Structure-assisted development of a continuous carboxypeptidase assay

Abstract

Glutamát karboxypeptidasa II (GCPII) je zinek-dependentní karboxypeptidasa s vysokou hladinou exprese u karcinomu prostaty. Vzhledem k tomu, že daný enzym představuje ověřený cíl pro terapii a zobrazování rakoviny, je vývoj nových ligandů specifických pro GCPII stále předmětem aktivního akademického a průmyslového výzkumu. Stávající analýzy pro screening knihoven inhibitorů a stanovení účinnosti inhibitorů nejsou však optimální. Tato diplomová práce je zaměřena na vývoj malých interně zhášených sond, které by mohly být použity pro kontinuální měření enzymatické aktivity GCPII. Tyto sondy jsou odvozeny z přirozených substrátů GCPII a sestávají z páru fluorofor/zhášeč spojeného GCPII- hydrolyzovatelným linkerem. Nejprve jsem charakterizovala biofyzikální vlastnosti sond a poté stanovila kinetické parametry jejich hydrolýzy GCPII. Optimalizovaná metoda pro stanovení karboxypeptidasové aktivity byla použita pro určení IC50 u několika GCPII-specifických inhibitorů. Nakonec komplexy mezi neaktivním enzymem a uvedenými sondami byly kokrystalizovány, a pro jeden z komplexů byly provedeny upřesnění a analýza struktury. Naše data naznačují, že sondy jsou zapojeny do nekovalentních interakcí se stejnými aminokyselinovými zbytky aktivního místa enzymu jako přirozené substráty. Vyvinutá analýza může být...

Glutamate carboxypeptidase II (GCPII) is a zinc-dependent carboxypeptidase with high expression levels in prostate carcinoma. As the enzyme represents a validated target for cancer therapy and imaging, the development of new GCPII-specific ligands is still a focus of an active academic and industrial research. However, existing assays to screen inhibitor libraries and determine inhibitor efficacy are suboptimal at best. This thesis is aimed at the development of small internally quenched probes that could be used for continuous measurement of the GCPII enzymatic activity. These probes are derived from natural GCPII substrates and consist of a fluorophore/quencher pair connected by a GCPII-hydrolysable linker. I first characterized biophysical properties of the probes and then determined kinetic parameters of their hydrolysis by GCPII. The optimized activity assay was then used to determine inhibition constants of several GCPII-specific inhibitors. Finally, complexes between the inactive enzyme and several probes were co-crystallized and one of the complexes refined and analyzed. Our data show that the probes are involved in non-covalent interactions with the same amino acid residues of the enzyme's active site as natural substrates. The developed assay could be optimized for high-throughput...