Využití průtokové cytometrie pro diagnostiku a charakterizaci dědičných poruch glykosylace

Abstract

Dědičné poruchy glykosylace (CDG) jsou vzácná multisystémová metabolická onemocnění, jejichž počet v posledních letech výrazně narůstá. Projevují se velmi širokým spektrem klinických příznaků. Ve většině případů jsou způsobeny mutací genů kódujících enzymy glykosylační dráhy. Na základě typu poruchy jsou syndromy CDG děleny do skupin: poruchy N-glykosylace nebo O-glykosylace proteinů, defekty v modifikaci proteinů pomocí GPI kotvy, defekty glykosylace lipidů a poruchy více glykosylačních drah zároveň. Cílem práce bylo najít nové biochemické analýzy vhodné pro diagnostiku a charakterizaci pacientů s CDG. Pro vybrané markery (Sambucus Nigra (SNA) lektin, proaerolysin (FLAER), protilátky proti proteinům CD55 a CD59) byly optimalizovány experimentální podmínky a značení byla následně aplikována na kultivované kožní fibroblasty kontrol a vybraných pacientů s CDG (ATP6AP1-CDG, PIGN-CDG, SLC10A7-CDG, deficit PISD) diagnostikovaných na základě celoexomového sekvenování. Experimenty byly prováděny za použití průtokové cytometrie (FACS) a fluorescenční mikroskopie (FM). Byla dosažena optimalizace detekce sializace pomocí SNA lektinu i analýzy změn mitochondriálního membránového potenciálu pomocí fluorescenčně značené sondy JC-1 se simulací defektu mitochondrií pomocí FCCP. Analýzou FACS i FM byla prokázána...

Congenital disorders of glycosylation (CDG) are rare multisystem metabolic diseases and their number has rapidly grown in recent years. The clinical manifestation includes very broad spectrum of symptoms. In most of all cases CDG are caused by mutations in genes encoding the enzymes of glycosylation pathway. Based on the type of defect, CDG are divided into the following groups: disorders of N-glycosylation or O-glycosylation of proteins, defects in modification of proteins by GPI anchor, disorders of lipid glycosylation and defects that impact multiple glycosylation pathways. The aim of the thesis was to find new biochemical analyses suitable for diagnostics and characterization of CDG patients. The experimental conditions were optimized for selected markers (Sambucus Nigra (SNA) lectin, proaerolysin (FLAER), antibodies to proteins CD55 and CD59) and the staining was applied to cultivated skin fibroblasts from controls and patients diagnosed with CDG by whole-exome sequencing (ATP6AP1-CDG, PIGN-CDG, SLC10A7-CDG, PISD deficiency). The experiments were performed using flow cytometry (FACS) and fluorescent microscopy (FM). The detection of sialylation by SNA lectin and analysis of the mitochondrial membrane potential changes by a fluorescent labelled probe JC-1 with FCCP simulation of mitochondrial...