Stanovení tryptofanu, serotoninu a melatoninu v rostlinném materiálu pomocí HPLC

Abstract

Tato práce se zabývá vývojem a optimalizací metody pro stanovení tryptofanu a jeho metabolitů - serotoninu a melatoninu - v rostlinném materiálu, konkrétně ve vinné révě, v průběhu jedné analýzy. Využívá k tomu analytickou metodu vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii. V teoretické části je nejprve pojednáno o tryptofanu. Je představen jeho metabolismus a základní vlastnosti metabolitů - serotoninu a melatoninu. Diskutován je jeho výskyt ve vinné révě. Jsou zde také uvedeny analytické techniky, pomocí nichž lze tyto analyty stanovit. Dále pak jsou zahrnuty informace o moderních stacionárních fázích, které jsou vhodné pro tento druh analýzy. Experimentální část tvoří optimalizace metody, měření kalibračních závislostí a reálných vzorků. Je měřeno metodou reverzní chromatografie, kdy jako stacionární fáze je nejprve použita kolona C18 s náplní core-shell, poté kolona BEH Phenyl. Jako mobilní fáze je použita směs 10 mM octanového pufru o pH = 4,5 a methanolu. Je využita UV detekce při vlnové délce 254 nm, pro větší citlivost pak hmotnostní detekce. Byly stanoveny základní podmínky experimentu. Na počátku analýzy obsahuje mobilní fáze 95 % (v/v) pufru a 5 % (v/v) methanolu. Poté je obsah methanolu od druhé do šesté minuty lineárně zvyšován na hodnotu 80 % (v/v), kde je mezi šestou a osmou minutou...

This thesis deals with the development and optimization of a method for the determination of tryptophan and its metabolites - serotonin and melatonin - in plant material, in grapevine, during one analysis. It uses a high-pressure liquid chromatography. The theoretical part is about tryptophan, its metabolism and basic properties of its metabolites - serotonin and melatonin. Their occurrence in wine is also discussed. Analytical techniques by which these analytes can be determined are also provided. Then information about modern stationary phases, that are suitable for this species, is included. The experimental part consists of optimization of the method, measurement of calibration dependences and measurement of real samples. It is measured by the method of reverse phase chromatography. As first stationary phase it is used a C18 column with core-shell packing, second is a BEH Phenyl column. The mixture of 10 mM acetate buffer (pH = 4.5) and methanol is used as the mobile phase. For detection UV at wavelength 254 nm is used, then for greater sensitivity mass detectionis is used. The basic conditions for the experiment have been set. At the beginning of the analysis, the mobile phase contains 95 % (v/v) buffer and 5 % (v/v) methanol. Then the methanol content is linearly increased to 80 % (v/v) from...