Synthesis and delivery of novel fluorescently-labelled nucleotides and their nucleic acids for bio-analytical applications

Abstract

1 Abstrakt Cílem disertační práce bylo syntetizovat nové fluorescenčně značené nukleotidy a odpovídající nukleové kyseliny pro bioanalytické aplikace a také pro jejich transport do buněk. Práce se také zaměřila na vývoj účinné metody pro inhibici netemplátové inkorporace nukleotidů. Problematická netemplátová enzymatická inkorporace nukleotidů je řešena použitím několika komerčně dostupných 5'-modifikovaných-oligonukleotidů. Oligonukleotidy (ON), které jsme testovali, obsahovaly ortho interkalující skupinu (oTINA), tritylovou skupinu nebo biotin na 5'-konci. Modifikované oligonukleotidy byly použity jako templáty v experimentech enzymatického prodloužení primeru (PEX) v přítomnosti buď modifikovaných nukleotidů nebo pouze přírodních deoxynukleosid trifosfátů (dNTP). Templáty oTINA byly použity pro PEX reakce s využitím přírodních dNTP a různých DNA polymeráz rodiny A nebo B. Souběžně byly nezávisle na sobě navrženy a syntetizovány dva typy fluorescenčních nukleosidových derivátů. Nejprve jsme navrhli nové fluorescenční nukleotidové značky obsahující hexamethylovanou BODIPY skupinu jako výraznou fluorescenční značku. Mimo to jsme se zaměřili na zlepšení fluorescenčních nukleotidových sond citlivých na viskozitu a polaritu. Fluorescenčně značené methylované BODIPY nukleotidy (dNmBdpTP) byly připraveny s...

1 Abstract The goals of the thesis were to synthesise novel fluorescently labelled nucleotides and the corresponding nucleic acids for bio-analytical applications as well as their delivery into cells. The thesis also aimed at the development of an effective method to inhibit non-templated incorporation of nucleotides. The problematic non-templated enzymatic incorporation of nucleotides is addressed by using several commercially available 5'-modified-oligonucleotides. The oligonucleotides (ONs) that we tested bore ortho twisted intercalating nucleic acid (oTINA), a trityl group, or biotin at the 5'-end. The modified ONs were used as templates in the enzymatic primer extension (PEX) experiments in the presence of either modified nucleotides or only natural deoxynucleoside triphosphates (dNTPs). The oTINA templates underwent PEX reaction using natural dNTPs and different DNA polymerases of the A or B family. In parallel, two types of fluorescent nucleoside derivatives were independently designed and synthesised. Firstly, we envisaged new fluorescent nucleotide tags containing the hexamethylated BODIPY moiety as a bright fluorescent label. Conversely, we focused on the improvement of fluorescent nucleotide probes sensitive to the viscosity or polarity. The fluorescently labelled methylated BODIPY nucleotides...