Structural characterization of biotechnologically and medicinally important proteins.

Abstract

A large number of biological processes depends on dynamics of protein structure and specific protein-protein and protein-ligand interactions occurring under specific native conditions in or outside of cells. Standard methods for protein structure analysis like x-ray crystallography, nuclear magnetic resonance or cryo-EM are able to obtain important atomic or near- atomic resolution protein structures, however these are usually a static snapshot of protein locked in a specific conformation and mostly in non-native conditions. Structural mass spectrometry on the other hand, allows to describe protein structure dynamics, protein-protein and protein-ligand interactions and obtain inter- and intraprotein distance constraints between amino acid residues, all while working with proteins in their native conditions and needing only a fraction of sample. In this work, hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) and classical proteomic approaches were used together with other methods to analyse biotechnologically important proteins of fungal cellulolytic system lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO) and cellobiose dehydrogenase (CDH) as well as plant-derived photosensitizer protein LOV2 with potential use in biologically targeted photodynamic therapy. These methods allowed us to follow...

Velké množství biologických procesů je závislé na strukturní dynamice proteinů a specifických protein-proteinových, nebo protein-ligandových interakcích závislých na specifických podmínkách uvnitř, či vně buněk. Analýza struktury proteinů klasickými metodami jako je rentgenová krystalografie, NMR, nebo nově cryo-EM poskytuje důležité struktury s atomárním rozlišením, avšak většinou ukazuje pouze statický obrázek bez detailů o dynamice, nebo transientních interakcích, a navíc často v nenativních podmínkách. Tyto detaily může doplnit strukturní hmotnostní spektrometrie, která umí poskytnout informace o proteinové dynamice, interakcích proteinů s jinými molekulami a také o specifických meziatomových vzdálenostech v samotných proteinech, nebo mez interakčními partnery, to vše při relativně nativních podmínkách. V této práci byla použita vodík/deuteriová výměna spojená s hmotnostní spektrometrií (HDX-MS), klasická proteomická analýza a turbidimetrie ke studiu biotechnologicky užitečných proteinů houbového celulolytického systému lytické polysacharidové monooxygenasy (LPMO) a celobiosadehydrogenasy (CDH) a rovněž fotosensitivní domény LOV2 pocházející z rostlinného fototropinu využitelné při fotodynamické terapii. Pomocí těchto metod byla sledována celulolytická reakce katalyzovaná redukovaným enzymem...