Mutageneze genů psbO1 a psbO2 v Arabidopsis thaliana pomocí metody CRISPR-Cas9

Abstract

Protein PsbO je jednou z nezbytných podjednotek fotosystému II, proteinového komplexu nacházejícího se v tylakoidních membránách chloroplastů. PsbO má důležitou funkci pro stabilizaci manganového klastru, na které probíhá rozklad vody a produkce kyslíku. V Arabidopsis thaliana mádvěizoformy,jejichžfunkcevšaknebyladoposuduspokojivěobjasněna.Dosavadní poznatky o izoformách PsbO1 a PsbO2 pochází zejména z experimentůprováděnýchnaT -DNA inzerčníchmutantech psbo1 a psbo2. Získáním životaschopnýchdvojitýchmutantů psbo1 psbo2 vyvstalaotázkaohledněmíryexpresemutovanýchgenůumutantů psbo1 a psbo2. Proto jsme pomocí metody CRISPR-Cas9 vytvořiliknock -out mutantní linie psbo1cr a psbo2cr, které jsme porovnali s doposud používan ými T-DNA inzerčními mutanty psbo1 a psbo2. Provedli jsme porovnání základních fenotypových charakteristik, parametrů fluorescence chlorofylu a a imunodotekciproteinůPsbO1aPsbO2.Výsledkyukazují,žeikdyžmožnáv T-DNAinzerčních mutantech probíhá slabáexpresemutovanýchgenů,měřenéparametrymutantů psbo1cr a psbo2cr jsou s nimi shodné. Klíčováslova: PsbO, fotosystém II, CRISPR-Cas9, mutageneze, Arabidopsis thaliana

PsbO protein is one of the essential extrinsic subunits of photosystem II, a protein complex that is embedded in thylakoid membranes of chloroplasts. PsbO is important in stabilizing manganese cluster, a structure that break down water molecules and evolves oxygen. Arabidopsis thaliana encodes for two isoforms which functions have not yet been clearly explained. Up-to- date information of PsbO1 and PsbO2 come from experiments using T-DNA insertion mutants psbo1 and psbo2. Finding viable double mutants psbo1 psbo2 had brought up questions about actual expression levels of mutated genes in psbo1 and psbo2 mutants. This is what led us to creating psbo1cr and psbo2cr knock-out mutant lines using the CRISPR-Cas9 mutagenesis and then comparing them to the frequently used T-DNA insertion mutants psbo1 and psbo2. We performed a comparison of basic phenotype characteristics, chlorophyll a fluorescence parameters and immunodetection of PsbO1 and PsbO2 proteins. Even though we might have observed slight expression of mutated genes in psbo1 and psbo2 lines, our results show that measured parameters of psbo1cr and psbo2cr are identical to those of psbo1 and psbo2. Key words: PsbO, photosystem II, CRISPR-Cas9, mutagenesis, Arabidopsis thaliana