Studium ligandů fosfatas z rodiny haloacidních dehalogenas

Abstract

Phosphatases of the haloacid dehalogenase superfamily are one of the cell's tools for dephosphorylation of many diverse endogenous and exogenous compounds. This work is aimed at enzymes Tt82 and cytosolic purine 5'-nucleotidase II (cN-II), two members of this large enzyme superfamily. The Tt82 originates in the hyperthermophilic archaeon Thermococcus thioreducens. Up to date, there is only a small amount of knowledge about properties and biological function of this enzyme. Based on its sequence and structure, it was predicted that the Tt82 should possess a phosphatase catalytic activity. Consequently, potential substrates of the Tt82 were proposed by the molecular docking. In this work, the phosphatase activity of the Tt82 was confirmed together with several of its substrates: AMP, D-glucose 1-phosphate, D-glucose 6-phosphate and p-nitrophenyl phosphate (pNPP). Activity towards AMP and pNPP was then characterized by steady-state kinetics at 37 řC and 60 řC. In consistence with its thermophilic origin, the Tt82 showed markedly higher activity towards both substrates at 60 řC. Nonetheless, the effectivity of the Tt82 catalytic activity towards these substrates was actually very low. This leads to assumption, that the identified substrates are probably not biologically relevant. On the other hand, it is quite...

Fosfatasy z rodiny haloacidních dehalogenas jsou jedním z nástrojů, prostřednictvím nichž buňky provádí defosforylaci velmi rozmanitého množství endogenních i exogenních sloučenin. Kromě mnoha jiných se mezi fosfatasy této rodiny řadí enzymy Tt82 a cytosolická purinová 5'-nukleotidasa II (cN-II), jimiž se tato diplomová práce zabývá. Enzym Tt82 pochází z termofilní archebakterie Thermococcus thioreducens a o jeho vlastnostech a biologické funkci je v současnosti známo jen málo. Na základě jeho strukturních a sekvenčních vlastností byla predikována fosfatasová katalytická aktivita a pomocí metody molekulového dokování navrženy potenciální substráty. Fosfatasová aktivita Tt82 byla v této diplomové práci potvrzena a spolu s tím nalezeno několik substrátů: AMP, D-glukosa-1-fosfát, D-glukosa-6-fosfát a p-nitrofenylfosfát (pNPP). Pro AMP a pNPP byla aktivita Tt82 detailně charakterizována při teplotách 37řC a 60řC a získány příslušné kinetické parametry. Aktivita enzymu byla pro oba substráty podstatně vyšší při teplotě 60 řC, což je v souladu s jeho původem z termofilního organismu. Efektivita katalytické aktivity Tt82 vůči identifikovaným substrátům je přesto poměrně nízká a patrně se tedy nejedná o biologicky relevantní substráty tohoto enzymu. Je však pravděpodobné, že Tt82 má mnohem širší substrátovou...