Utilization of protein radical foootprinting for stuctural biology
Využití radikálového značení bílkovin pro strukturní biologii
diplomová práce (OBHÁJENO)
Zobrazit/ otevřít
Trvalý odkaz
http://hdl.handle.net/20.500.11956/119813Identifikátory
SIS: 207304
Kolekce
- Kvalifikační práce [19966]
Autor
Vedoucí práce
Konzultant práce
Kukačka, Zdeněk
Oponent práce
Junková, Petra
Fakulta / součást
Přírodovědecká fakulta
Obor
Biochemie
Katedra / ústav / klinika
Katedra biochemie
Datum obhajoby
15. 7. 2020
Nakladatel
Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakultaJazyk
Angličtina
Známka
Výborně
Klíčová slova (česky)
rychlá fotochemická oxidace proteinu, protein-DNA komplexy, FOXO4, transkripční faktory, kapilární průtokový reaktor, excimerový laser, bottom-up přistup, top down přistupKlíčová slova (anglicky)
Fast photochemical oxidation of proteins, protein-DNA complexes, FOXO4, transcription factor, quench flow system, protein footprinting, mass spectrometry, bottom-up, top-down(In Czech) Mapování povrchu proteinů je jednou z metod strukturní biologie, které poskytují důležité informace o struktuře, dynamice, funkci a vazebných interakcích proteinů. V této práci jsme se k mapování povrchu proteinů rozhodli využít unikátní přístup, kterým je kombinace hmotnostní spektrometrie s rychlou fotochemickou oxidací proteinů (FPOP, z anglického Fast Photochemical Oxidation of Proteins), která k tomuto účelu využívá reaktivní radikály kyslíku. Konkrétně byla v této práci metoda FPOP využita ke studiu interakce proteinu s DNA a to přesněji komplexu DNA-vázající domény proteinu FOXO4 s oligonukleotidem DAF16. V první fázi projektu byl produkován a purifikován protein, jehož vazba na DNA byla ověřena nativní elektroforézou a nativní hmotnostní spektrometrií. Dále byly optimalizovány podmínky oxidace proteinu, a to jak v přítomnosti DNA, tak samostatně a modifikace proteinu byly analyzovány hmotnostní spektrometrií pomocí přístupů top-down a bottom-up. Přístupem bottom-up byla identifikována a kvantifikována modifikovaná residua, což odhalilo rozdíly v oxidaci jednotlivých aminokyselin v přítomnosti a nepřítomnosti DNA. Aby se předešlo možným artefaktům způsobených analýzou vícenásobně oxidovaného proteinu, byla kromě hmotnostně spektrometrické analýzy standardním přístupem bottom-up...
(In English) The reaction of highly reactive oxygen radicals with protein solvent-accessible residues can be utilized to map protein landscape. Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is an MS- based technique, which utilizes highly reactive radical species to oxidize proteins and map protein surface or its interactions with their interaction partners. In this work, FPOP was employed to study protein-DNA interactions. First, a full-length of FOXO4-DBD was successfully expressed and purified. The ability of the protein to bind its DNA-response element was verified by electrophoretic and MS-based techniques, respectively. Optimal experimental conditions were achieved to oxidize the protein itself and in the presence of DNA, respectively. Oxidized samples were analyzed by bottom-up and top-down approach. In the bottom-up experiment, modification of individual residues was precisely located and quantified. Different extend of modification was observed for protein alone and in complex with DNA. To avoid experimental artifacts analyzing multiply oxidized protein, standard bottom up approach was replaced by a progressive top-down technology. Only a singly oxidized protein ion was isolated, and further fragmented by collision-induced dissociation (CID) and electron-capture dissociation (ECD),...
Citace dokumentu
Metadata
Zobrazit celý záznamSouvisející záznamy
Zobrazují se záznamy příbuzné na základě názvu, autora a předmětu.
-
Applications of graph theory in protein function prediction
Výsledek obhajoby: OBHÁJENOKalábová, Nikola (Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakulta, 2021)Datum obhajoby: 8. 6. 2021Rapidní vývoj celogenomových sekvenačních metod a jejich snižující se cena za- příčinila existenci velkého množství osekvenovaných genomů. Vývoj spolehlivých in-silico metod pro anotaci rychle rostoucího počtu osekvenovaných ... -
Funkční studie potenciální nukleotidázy kódované genem spr1057 Streptococcus pneumoniae, homologa proteinu YjjG E. coli
Výsledek obhajoby: OBHÁJENOVacková, Zuzana (Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakulta, 2010)Datum obhajoby: 31. 5. 2010ČESKÝ ABSTRAKT Funkční studie potenciální nukleotidasy kódované genem spr1057 v Streptococcus pneumoniae, homologa proteinu YjjG Escherichia coli. Bakteriální buňky jsou neustále vystavovány nespočetným toxickým látkám, ... -
Role of the ubiquitin-like protein, Hub1, in the pre-mRNA splicing regulation
Výsledek obhajoby: OBHÁJENOHubáčková, Tereza (Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakulta, 2018)Datum obhajoby: 4. 6. 2018Splicing is a key step of eukaryotic gene expression and as well as other steps of this vital process, splicing has to be tightly regulated. Hub1 protein is a ubiquitin-like protein which noncovalently interacts with ...