The novel combinations of experimental approaches: mass spectrometry (MS) and photo-induced surface labelling, electron release (PIER), or cross-linking (PIXL)

Abstract

V živých organismech probíhá každým okamžikem nespočet dějů s účastí přenosu/transportu elektronu (ET). Proto jejich studium je důležitým cílem moderní strukturně-funkční proteomiky. Pro řadu experimentů byl a je používán modelový protein azurin z P. aeruginosa. Tento modrý protein obsahující centrální atom mědi má charakteristické absorpční maximum při 630 nm v redoxním stavu Cu(II). Během jeho oxidace na Cu(I) dochází k poklesu hodnoty absorbance při 630 nm (A630) a tak lze UV-Vis spektra použít pro sledování průběhu jeho ET reakcí. Naším cílem bylo vložit světlem aktivovatelný strukturní analog kanonické aminokyseliny Met - L-2-amino-5,5-azihexanovou kyselinu (foto-Met) - do sekvence azurinu a využít vzniklý proteinový produkt pro studium oligomerizace azurinu v roztoku pomocí techniky světlem iniciovaného síťování (PIXL). Použitím optimalizovaných protokolů pro rekombinantní expresi v E. coli B834 jsme vložili foto-Met do přirozeného azurinu a konstruktu Az2W, ve kterém jsou přítomny dva blízké Trp, u kterých byla potvrzena role při elektronovém přeskoku ("hopping") napříč protein-proteinovým rozhraním. Míra inkorporace foto-Met do sekvence proteinů byla určena pomocí MALDI-TOF MS po separaci proteinů na SDS-PAGE a štěpení proteasou v gelu. Pomocí metody PIXL byl studován vliv rostoucí celkové...

Countless electron transport/transfer (ET) processes occur in living organisms every day. Therefore, their study is a crucial field of modern structural and functional proteomics. In many cases model proteins like azurin from P. aeruginosa are utilised in experiments. This blue copper protein is favoured due to a characteristic absorbance maximum at 630 nm in Cu(II) redox state of the central Cu atom. During its oxidation to Cu(I) state the A630 value decreases allowing UV-Vis detection of ET reaction progress. We have introduced a structural photoinducible analogue of canonical amino acid Met - L-2-amino-5,5-azihexanoic acid (photo-Met) - into azurin structure to study oligomerization in solution via photo-induced cross-linking (PIXL). Using previously optimised protocols for recombinant expression in E. coli B834 we have inserted photo-Met into azurin moieties: wild type azurin and Az2W mutant where two adjacent W residues with confirmed role in electron hopping across protein-protein interface are present. The incorporation percentage of photo-Met in analysed samples was determined after SDS-PAGE and in-gel protease digestion via MALDI-TOF MS. PIXL was employed to study azurin-azurin interaction and oligomerization under different total concentrations of protein (in range of 15-300 µM). The...