Studium struktury komplexů proteinu 14-3-3 s CaMKK1 a CaMKK1:Ca2+/CaM

Abstract

Ca2+ -signální dráha je jedním z nejvýznamnějších mechanismů přenosu informace v buňce. Rodina Ca2+ /kalmodulin-dependentních proteinkinas (CaMKs) je skupina se- rin/threonin kinas, jejichž aktivita je regulována intracelulární koncentrací iontů Ca2+ a vazbou receptorového proteinu iontů Ca2+ kalmodulinu (CaM). Součástí této pro- teinové rodiny je tzv. Ca2+ /CaM-dependentní kaskáda, jejímž členem je Ca2+ /CaM- dependentní proteinkinasa kinasa (CaMKK), která se u savců nachází ve dvou iso- formách, CaMKK1 a CaMKK2. Aktivita CaMKK1 je regulována nejen vazbou kalmodulinu, ale i fosforylací cAMP- dependentní proteinkinasou A, která zároveň ve struktuře CaMKK1 vytváří vazebné motivy rozpoznávané regulačními proteiny 14-3-3. Dřívější studie interakce CaMKK1 s proteiny 14-3-3 naznačily, že tato interakce nejen udržuje neaktivní CaMKK1 v inhi- bovaném stavu, ale také znepřístupňuje její aktivní místo a přímo inhibuje aktivitu CaMKK1. Struktura proteinového komplexu, který vzniká mezi CaMKK1 a 14-3-3 proteinem je však stále neznámá. Hlavním cílem této práce bylo charakterizovat proteinové komplexy vznikající in- terakcemi mezi CaMKK1, kalmodulinem a proteinem 14-3-3γ, a to pomocí metod ana- lytické ultracentrifugace,...

The Ca2+ -signaling pathway is an important mechanism of cell signaling. Ca2+ /Cal- modulin (CaM)-dependent protein kinases (CaMKs) are members of Ser/Thr protein kinase family. CaMKs are regulated by Ca2+ /CaM binding in response to increase in intracellular level of Ca2+ . An important member of this protein family is Ca2+ /CaM- dependent protein kinase kinase (CaMKK), which is an upstream activator of CaMKI and CaMKIV. There are two isoforms of CaMKK, CaMKK1 and CaMKK2. CaMKK1 is regulated not only by Ca2+ /CaM-binding, but also by phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase A (PKA). PKA phosphorylation induces inter- action with the 14-3-3 proteins. Previous studies of interaction between CaMKK1 and 14-3-3 proteins suggested, that the interaction with 14-3-3 proteins keeps CaMKK1 in the PKA-induced inhibited state and blocks its active site. However, the exact mecha- nism of this inhibition is still unclear mainly due to the absence of structural data. Main aim of this diploma thesis was to characterize the protein complexes between CaMKK1, Ca2+ /CaM and 14-3-3γ using analytical ultracentrifugation, small angle X-ray scattering, and chemical cross-linking coupled to mass spectrometry. Analytical ultracentrifugation revealed concentration-dependent dimerization of CaMKK1, which is...