Construction of modified DNAs with selected reactive or protective groups

Abstract

This PhD thesis is focused on the synthesis of DNA modified with photocleavable 2- nitrobenzyl protecting groups in major groove and its applications in the regulation of gene expression in the level of transcription. In the first part of my thesis, the synthesis of photocaged 2'-deoxyribonucleosides triphosphates and their photolysis to unprotected 5-hydroxymethylated nucleotides is described. All prepared nucleoside triphosphates were good substrates for their enzymatic incorporation into DNA. Synthesized 5-(2-nitrobenzyloxy)methyl-2'-deoxyuridine-5'- monophosphate (dUNBMP) and DNA with one 5-(2-nitrobenzyloxy)methyl- modification in the sequence were used for the detailed kinetic studies of photocleavage reactions. In the second part of the thesis, the series of modified DNAs with specific sequences were prepared by primer extension (PEX) and/or polymerase chain reaction (PCR). A cleavage of prepared modified DNAs was studied by selected restriction endonucleases (REs). In all cases, the nitrobenzylated DNA fully resist the cleavage by REs. The deprotection/ photocleavage conditions for nitrobenzylated DNA were studied in the case of DNAs with positive restriction endonuclease digestion of hydroxymethylated DNA. The resulting photocleaved DNA was fully digested by REs, therefore 2-nitrobenzyl...

Tato dizertační práce je zaměřená na syntézu DNA modifikované pomocí fotolabilních 2-nitrobenzylových chránících skupin a jejich aplikace v procesu regulace genové exprese. V první části mojí disertační práce je popsaná syntéza 2'-deoxyribonucleozid trifosfátu chráněných fotolabilními chránicími skupinami a jejich fotolýza na odchráněné hydroxymethylové trifosfáty. Všechny připraveny nukleosid trifosfáty byly dobrými substráty pro jejich enzymatickou inkorporaci do DNA. Syntetizovaný 5-(2-nitrobenzyloxy)methyl-2'- deoxyuridin-5'-monofosfát (dUNBMP) a DNA s jednou 5-(2-nitrobenzyloxy)methyl- modifikaci v sekvenci byli použity v podrobné studii kinetiky fotolytických reakcí. V druhé časti disertační práce byla připravena série modifikovaných DNA se specifickou sekvenci pomoci PEX a/nebo PCR. Štěpení modifikované DNA bylo studováno v přítomnosti vybraných restrikčních endonukleáz (RE). Ve všech případech byla DNA modifikovaná nitrobenzylovými skupinami úplně rezistentní vůči štěpení RE. V případě hydroxymethylové DNA s pozitivním štěpením pomoci RE, byly studovaný podmínky ochránění 2-nitrobenzylových zbytku na DNA, tedy 2-nitrobenzylové skupiny se jeví jako využitelné, bioortogonální přechodní chránění DNA proti štěpení restrikčními endonukleázami. V závěrečné časti, byly syntetizované...