Klinická klasifikace sekvenčních variant v nekódujících regulačních oblastech genů predisponujících ke vzniku karcinomu prsu.

Abstract

Inaktivace tumor supresorového genu BRCA1 příčinou vysokého celoživotního rizika vzniku karcinomu prsu a dalších malignit. Plošný genetický skríning indikovaných jedinců z vysoce rizikových rodin dovoluje identifikovat množství sekvenčních variant v dosud známých predispozičních genech. Většina nově nalezených variant dosud nemá jasný klinický význam a představuje tak z hlediska diagnostiky závažný problém. Část těchto variant se nachází i v nekódujících regulačních oblastech genů. Součástí procesu klinické klasifikace variant je jejich funkční charakterizace. Cílem této práce bylo vytvořit modelový systém pro funkční charakterizaci variant v nekódujících oblastech a následně ověřit jeho funkčnost. Modelový systém byl založen na cílené genové manipulaci pomocí ko-transfekce CRISPR- Cas9 a donorového konstruktu s částí sekvence genu BRCA1, ve které byly zavedeny analyzované modifikace, do U2 OS buněk. Tyto buňky v sobě mají stabilně vložený DR-GFP systém dovolující stanovit aktivitu homologní rekombinace (HR). Do U2 OS buněk se nakonec podařilo zavést monoalelické modifikace. Tyto modifikace se nacházely v oblasti sekvence Kozakové genu BRCA1. Nejdříve byla pomocí qRT-PCR stanovena exprese na úrovni mRNA BRCA1, která byla u všech buněk s analyzovanými alteracemi stejná. Dále byla stanovena exprese...

Inactivation of tumor supressor gene BRCA1 causes a life-long risk of breast carcinoma development. Genetic screenings of indicated individuals from high-risk families help to identify large number of sequence variants in known predisposing genes. Majority of discovered variants doesn't have clinical significance yet which causes a big problem for diagnostics. Some of these variants are found within regulatory non-coding regions of gene. A part of the clinical classification of variants is their functional characterization. The goal of this thesis was to create a model system for functional characterization of variants in non-coding regions and to verify its function. Model system was based on targeted gene manipulation by co-transfecting CRISPR-Cas9 construct and donor construct that contained a portion of BRCA1 gene sequence with analyzed modifications, into U2 OS cells. The cells have stably integrated DR-GFP system which allows the activity of homologous recombination (HR) to be determined. Monoallelic modifications were induced into U2 OS cells. These modifications were in a Kozak sequence region of BRCA1 gene. Expression level of BRCA1 mRNA was determined by qRT-PCR, which showed the same levels of mRNA in all cells with analyzed alterations. Next, expression level of BRCA1 protein was...