Studium systému oxidativní fosforylace u vzácných typů mitochondriálních onemocnění

Abstract

In their bioenergetic metabolism mammalian cells are primarily dependent on ATP production through the oxidative phosphorylation system (OXPHOS). Defects of OXPHOS function can lead to occurrence of mitochondrial disorders with different severity and diverse symptoms. Most severely affected are usually tissues with high energy demand which are also difficult to access for biochemical and other examinations. The aim of this thesis was mainly to characterize the effects of mutations in seven different genes (OPA1, DARS2, NDUFS8, NR2F1, HTRA2, MGME1, POLG) on bioenergetic metabolism and mitochondrial network structure of skin fibroblasts from eight different patients diagnosed with mitochondrial disorders. The main method used was measurement of oxygen uptake by permeabilized cells using highly sensitive polarography. Significant changes in fibroblast respiration of four patients were found. Changes in mitochondrial network morphology were found in two of those and two other patient cell lines compared to controls using fluorescent microscopy and different cultivating conditions. Skin fibroblasts are relatively easy to obtain and offer a number of benefits for both diagnostic and study purposes. The results of this work illustrate the possibilities of their use for validation of potential causal...

Buňky savců jsou ve svém bioenergetickém metabolismu závislé na produkci ATP především pomocí systému oxidační fosforylace (OXPHOS). Poruchy správné funkce OXPHOS mohou vést ke vzniku dědičných mitochondriálních onemocnění s různou závažností a rozmanitými projevy. Nejvážněji bývají zasaženy tkáně s vysokými energetickými nároky, které jsou však obtížně dostupné pro biochemická a jiná vyšetření. Cílem práce bylo především charakterizovat dopady mutací sedmi různých genů (OPA1, DARS2, NDUFS8, NR2F1, HTRA2, MGME1, POLG) na bioenergetický metabolismus a strukturu mitochondrií kožních kultivovaných fibroblastů osmi pacientů s mitochondriálním onemocněním. Hlavní použitou metodou bylo měření spotřeby kyslíku permeabilizovanými buňkami pomocí vysoce citlivé polarografie. Tímto způsobem byly zjištěny výrazné změny v respiraci fibroblastů čtyř pacientů. U dvou z nich a dvou dalších linií byly pomocí fluorescenční mikroskopie zjištěny změny morfologie mitochondriálního retikula oproti kontrolám při použití různých kultivačních podmínek. Kožní fibroblasty jsou relativně snadno dostupné a nabízí řadu výhod pro účely diagnostiky i studia. Výsledky této práce ilustrují možnosti jejich využití mj. pro validaci potenciálních kauzálních mutací mitochondriálních onemocnění, především však v kombinaci s dalšími...