Molecular details of translation reinitiation in budding yeast

Abstract

Eukaryotická iniciace translace je vysoce komplexní proces zahrnující celou řadu fází. Iniciace translace je zahájena sestavením preiniciačního komplexu 43S, který nasedá na 5' čepičku mRNA a následně pročítá mRNA za účelem rozpoznání vhodného AUG start kodónu. Po rozeznání AUG kodónu většina iniciačních faktorů z komplexu 48S disociuje. Některé z těchto faktorů nicméně zůstávají s komplexem 48S přechodně asociované, jedná se například o eIF3 a nejspíše o eIF4G. V rámci této práce jsme vyvinuli metodu RNA-protein Ni2+ -pull down (Rap-Nip), která slouží k in vivo detekci fragmentů mRNA navázaných na eIF3 v kvasinkách. Ukázali jsme, že eIF3 kvasinky Saccharomyces cerevisiae zůstává po iniciaci translace perzistentně navázán na elongujících ribozomech po dobu několika elongačních cyklů. eIF3 navíc stabilizuje post-terminační komplex 40S na stop kodónu krátkých čtecích rámců uORF1 a uORF2 GCN4 a to prostřednictvím kontaktu mezi N-terminální částí podjednotky a/TIF32 a elementy podporujícími reiniciaci (RPEs) příslušného uORF GCN4. S využitím β-galaktosidázového reportérového systému jsme odhalili, že AU- bohatý motiv (motiv AU1-2A/ UUAU2) nacházející se těsně za stop kodonem reiniciačně (REI)-permisivních uORFs podporuje autonomně a místně specificky reiniciaci. Rovněž jsme ukázali, že přesná délka...

Eukaryotic translation initiation is a complex multi-step process. It begins with the formation of 43S pre-initiation complex (PIC), which binds to the 5' cap of the mRNA, scans downstream searching for an appropriate AUG start site. Upon AUG recognition by 48S PIC, most of the initiation factors dissociate. However, some initiation factors, such as eIF3 and may be eIF4G, remain transiently associated with the 48S PIC. Here, we have developed a yeast in vivo RNA-Protein Ni2+ -Pull down (Rap-Nip) assay for in vivo detection of eIF3 bound mRNA fragments. In Saccharomyces cerevisiae, we demonstrated showing that, after initiation, eIF3 persistently associated with the elongating ribosomes for few elongation cycles. Further, it stabilizes the post- termination 40S complex on the stop codon of both uORF1 and 2 by establishing a contact between the N-terminal domain of a/TIF32 subunit and the Reinitiation Promoting Elements (RPEs) of corresponding uORFs on GCN4. Furthermore, employing the β-galactosidase reporter assays we revealed that AU-rich motif (AU1-2A/ UUAU2 motif) that occurs immediately following the stop codon of reinitiation (REI)- permissive uORFs promotes REI in position-specific autonomous fashion. We also have shown that the exact length and the last coding triplet of the REI-permissive...