Proteomic analysis of myocardial integral membrane proteins

Abstract

Kardiovaskulární onemocnění představují nejvyšší zdroj mortality i morbidity v Evropě. Více než 4 miliony lidí ročně na tato onemocnění zemře a více než 11 milionů nových případů kardiovaskulárních onemocnění se objeví každý rok. Tato čísla jen poukazují na to, že je zde potřeba nejen pro lepší diagnostické, prognostické a prediktivní biomarkery, ale také potřeba pro nové a efektivnější léky. Integrální membránové proteiny (IMP) jsou ideálními kandidáty na nové cíle léčiv. Analýza IMP stále představuje jeden z hlavních problémů současné proteomiky. Důvodem je nízká úroveň exprese IMP, jejich snížená rozpustnost ve vodě a také nedostatek trypsinových štěpných míst v transmembránových segmentech. Byla vyvinuta celá řada metod, které se snaží tyto problémy obejít. Jedná se zejména o metody, které selektivně cílí na N-glykosylované segmenty IMP (CSC, SPEG, N-glyco-FASP), a nebo metody, které naopak cílí na hydrofobní transmembránové segmenty (hpTC). My jsme se v této práci rozhodli spojit dva přístupy, které cílí na N-glykosylované extramembránové segmenty IMP (SPEG a N-glyco-FASP) provedené na dvou typech vzorku (na celotkáňovém lyzátu a membránové frakci) spolu s hpTC metodou, která naopak cílí na hydrofobní transmembránové segmenty a s necíleným "detergent+trypsin" přístupem. Tento kombinovaný...

Cardiovascular diseases (CVD) are the leading cause of morbidity and mortality in Europe. Over 4 million people die from CVDs annually and another 11 million people develops CVDs every year. These numbers show that there is a need for better diagnostic, prognostic and predictive biomarkers and, more importantly, a need for new and more efficient drugs. Integral membrane proteins (IMPs) are ideal candidates for new drug targets. However, a study of IMPs represents a major challenge in current proteomics. This challenge is associated with the low abundance of IMPs, their low solubility in aqueous solvents and the absence of trypsin cleavage sites in their transmembrane segments. To overcome these issues, methods that selectively target either N-glycosylated extra-membrane segments (CSC, SPEG, N-glyco-FASP) or transmembrane segments (hpTC) were developed. In this thesis we employed a combination of two N-glyco-capture methods (SPEG and N-glyco-FASP) performed on two different samples (membrane-enriched fraction and total tissue lysate) with analysis of membrane-embedded IMP segments by hpTC and with standard non-targeted "detergent+trypsin" approach to analyze rat myocardial membrane proteome. We also performed an evaluation of employed methods for preparation of membrane fraction by western blot...