Model membranes studied by advanced fluorescence techniques and molecular dynamics simulations

Abstract

Úvod této práce se věnuje popisu biofyzikálních vlastností modelů plazmatic- ké membrány během procesů buněčné signalizace, jako je zvýšená koncentrace cytosolické koncentrace vápníku nebo posttranslační modifikace membránových proteinů. Vápníková signalizace je charakteristická rychlým nárůstem koncen- trace vápníku v cytosolu buňky. V našem výzkumu jsme identifikovali specifická vazebná místa pro vápník a charakterizovali jeho vázání v modelech plazmatic- ké membrány se vzrůstající složitostí. Začali jsme s nejjednodušším modelem dvouvrstvy fosfolipidů, dále obohacené o cholesterol a peptidy. Nejsložitějším modelem pak jsou membrány extrahované z buněk HEK293. V experimentech používáme metodu časově závislého posunu fluorescence, která poskytuje přímou informaci o hydrataci a mobilitě v definovaných místech studované membrány. Experimenty jsou doplněny o molekulárně dynamické (MD) simulace, díky kterým získáme molekulární detail studovaných interakcí. Signalizace PAG proteinu je spuštěna jeho dvojí palmitoylací. Naše studium je zaměřeno na změny v biofyzikálních charakteristikách jak samotného peptidu, tak okolní lipidové membrány po připojení těchto palmitoylů. Za pomoci ato- mistických MD...

In this thesis, we start with the description of the biophysical properties of the plasma membrane models upon signaling processess such as the increased cytoso- lic concentration of calcium ions, or posttranslational modifications of membrane proteins. Calcium signaling is characterized by a rapid increase of its cytosolic concentration. We identify calcium binding sites and characterize the binding in the plasma membrane models of increasing complexity from pure phospholipid bilayers, through cholesterol and peptide rich lipid membranes, to membranes ex- tracted from HEK293 cells. We use Time-Dependent Fluorescent Shift method, which provides direct information on hydration and mobility in defined regions of a lipid bilayer, accompanied with molecular dynamic (MD) simulations, which give molecular details of the studied interactions. The initial step of signaling mediated by PAG protein is its double palmi- toylation. We investigate changes of the biophysical properties of both the lipid membrane and the peptide itself upon the incorporation of the palmitoyls. Em- ploying all atom MD simulations, we study inter- and intramolecular interactions as well as changes in membrane hydration, thickness, or lipid ordering. The second part of the thesis, realized in a direct collaboration with a phar- macological...