Mutantní glykosidasy s vysokou substrátovou specifitou a jejich analýza

Abstract

β-N-Acetylhexosaminidasy (EC 3.2.1.52, GH20) jsou retenující exo-glykosidasy, které in vivo odštěpují jak β-N-acetylglukosamin (GlcNAc), tak β-N-acetylgalaktosamin (GalNAc) z glykosylovaných struktur. Za vhodných reakčních podmínek jsou tyto enzymy schopné glykosidovou vazbu i syntetizovat. Cílenou mutagenezí v aktivním centru enzymu lze např. dosáhnout změny substrátové specifity nebo potlačit hydrolytickou aktivitu enzymu ve prospěch syntézy. Předkládaná práce se zabývá třemi mutantními β-N-acetylhexosaminidasami z Talaromyces flavus. V jejich aktivním centru byla provedena záměna aminokyselinových zbytků, které jsou zodpovědné za vazbu hydroxylu na C-4 substrátu (Arg218, Glu546), za aminokyseliny navržené na základě molekulárního modelování. Byl studován vliv vnesených jednobodových mutací na substrátovou specifitu připravených enzymů. Mutantní β-N-acetylhexosaminidasy byly heterologně exprimovány v Pichia pastoris a charakterizovány. Dále byly provedeny transglykosylační reakce s těmito enzymy. Připravené sacharidové produkty byly charakterizovány pomocí NMR.

β-N-acetylhexosaminidases (EC 3.2.1.52, GH 20) are retaining exo-glycosidases that in vivo cleavage both β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) or β-N-acetylgalactosamine (GalNAc) residues fom glycostructures. Under suitable reaction conditions, these enzymes are able to synthesize the glycosidic bond in good yields. Substitution of selected amino acid(s) in the emzyme active site by site-directed mutagenesis may change the enzyme's substrate specificity or suppress the hydrolytic activity of the enzyme in favor of synthesis. The present thesis deals with three mutant β-N-acetylhexosaminidases from Talaromyces flavus, in which the amino acid residues responsible for binding to C-4 hydroxyl of the substrate (Arg218, Glu546) were exchanged for amino acids proposed on the basis of molecular modeling. The effect of introduced single point mutations on substrate specificity of prepared enzymes was studied. Mutant β-N-acetylhexosaminidases were heterologously expressed in Pichia pastoris and characterized. Furthermore, transglycosylation reactions with these enzymes were performed. The prepared carbohydrate products were characterized by NMR.