Výhody a nevýhody zvýšené teploty při separaci peptidů na obrácených fázích

Abstract

Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Tomáš Šemlej Školitel: PharmDr. Juraj Lenčo, Ph.D. Název diplomové práce: Výhody a nevýhody zvýšené teploty při separaci peptidů na obrácených fázích V současné době jsou pro LC-MS analýzy proteinů dostupné velice výkonné hmotnostní spektrometry, díky kterým lze v rámci jedné tzv. bottom-up analýzy identifikovat až několik tisíc proteinů. Nedávno však bylo zjištěno, že jejich možnosti nemohou být plně využity bez zvýšení účinnosti chromatografické separace peptidů. Účinnost separace peptidů může být zvýšena velmi jednoduchým, ale mnohdy opomíjeným způsobem, a sice pomocí vyšší teploty kolony. Vyšší teplota přispívá k účinnější separaci především lepší difuzí peptidů. Na druhou stranu použití vyšších teplot pro účinnější separace omezuje stabilita jak stacionární fáze, tak separovaných peptidů. V rámci diplomové práce jsme nejprve ověřovali vliv teploty na účinnost separace peptidů na kolonách naplněných buď plně porézními částicemi, nebo povrchově porézními částicemi. Zvýšená teplota kolony s plně porézními částicemi poskytla užší píky, zatímco rozdíly v šířce píků na koloně s povrchově porézními částicemi byly minimální. Dále jsme pomocí modelového proteinu zkoumali tepelnou stabilitu peptidových vazeb...

Charles University, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Tomáš Šemlej Supervisor: PharmDr. Juraj Lenčo, Ph.D. Title of diploma thesis: Pros and cons of using elevated temperature for peptide separation using reversed phases Nowadays, powerful mass spectrometers are available for bottom-up LC-MS proteomic analyses. They allow to identify up to several thousand proteins in one bottom-up analysis. It has been recently demonstrated, however, that their capabilities cannot be fully exploited without significant improvements in peptide separation. One of the easiest, but often neglected, ways to enhance peptide separation efficiency is to increase column temperature. Elevated column temperature may contribute to more efficient separation especially by increasing low diffusivity of peptides. On the other hand, stability of both a stationary phase and peptides limits increasing column temperature to values affording maximum effect on separation efficiency. In this thesis, we explored the effect of increased column temperature on peptide separation efficiency using columns packed either with superficially porous particles or with fully porous particles. Elevated column temperature narrowed peaks for peptides eluted from fully porous particles whereas peak...