Analysis of Histone Deacetylase 6/Kinesin Interactions

Abstract

Intracelulární transport je zajišťován dvěma typy molekulárních motorů, kinesiny a dyneiny. Kinesin-1 zprostředkovává transport molekul and organel podél mikrotubulů směrem k jejich plus konci. Specifické protein-proteinové interakce jsou nezbytné k aktivaci kinesinu, protože volný kinesin je autoinhibován. Aktivace kinesinu je spojena se změnou jeho konformace. Aktivovaný kinesin se váže na mikrotubuly a za hydrolýzy ATP přenáší navázané molekuly a organely. HDAC6 je multifunkční protein složený z několika domén. Je důležitým regulačním faktorem v mnoha procesech týkajících se mikrotubulů. HDAC6 je totiž hlavním enzymem deacetylujícím mikrotubuly. Bylo popsáno, že inaktivace HDAC6 ovlivňuje transport na mikrotubulech, nicméně mechanismus těchto změn není znám. Inaktivace HDAC6 může tyto změny působit kvůli posttranslační modifikaci mikrotubulů nebo přímou interakcí s molekulárními motory. Tato diplomová práce je zaměřena na charakterizaci dosud nepopsané interakce mezi kinesinem-1 a HDAC6. Za tímto účelem byla provedena exprese a purifikace navržených konstruktů obou proteinů. Tyto konstrukty byly analyzovány pomocí mikroskopické termoforézy (MST) pro stanovení jejich vzájemné afinity a vodík-deuteriové výměny (HDX), kterou byly interakce popsány ze strukturního hlediska. Podle MST je afinita mezi...

Intracellular transport is provided by two major types of molecular motors kinesins and cytoplasmic dynein. Kinesin-1 is a molecular motor that transports molecules and organelles along microtubule tracks anterogradely. Specific protein-protein interactions are required to activate kinesin-1 as the free kinesin exist in an autoinhibited state. The activation of kinesin-1 induces its conformational change, enables microtubule binding and ATP hydrolysis necessary for the directional cargo transport. HDAC6 is a multifunctional protein composed of several domains. It plays an important role in many microtubule dependent processes as HDAC6 is a major tubulin deacetylase. It has been shown that HDAC6 manipulation (inhibition/genetic ablation) affects transport along microtubules but the exact mechanisms are unknown. The effect can be caused either by deacetylation microtubules or direct interaction with molecular motors. This thesis is focused on characterization of interactions between kinesin-1 and HDAC6 that have not been described so far. To this end, we expressed and purified various constructs of kinesin-1 and HDAC6 and tested their interactions by microscale thermophoresis (MST) and hydrogen deuterium exchange (HDX) to determine affinity and interaction sites, respectively. MST data revealed that...