Strukturní studie mechanismů opravy poškozené DNA Nei glykosylasou

Abstract

Abazické místo (Ap z angl. Apurinic/apyrimidinic) je jedno z nejrozšířenějších poškození DNA vznikající spontánní hydrolýzou nebo v průběhu DNA opravných procesů. Jedna z forem Ap je otevřený aldehyd s elektrofilní funkční skupinou schopnou vytvářet kovalentní spojení s nukleofilní skupinou komplementárního řetězce DNA. Kovalentní spojení protilehlých řetězců (ICL z angl. Interstrand cross-link) vycházející z Ap je poškození, kde je nepřirozená N-glykosidová vazba tvořena spontánně mezi otevřeným aldehydem a aminovou skupinou adeninu na komplementárním řetězci dvouřetězcové DNA. ICL blokuje replikaci a transkripci, což vede ke genomové nestabilitě, rakovině nebo smrti buňky. Proces vzniku ICL je relativně dlouhý, trvající několik hodin, kde vznik otevřeného aldehydu Ap je limitujícím krokem. Dosud byly popsány dva druhy Ap-ICL v závislosti na bázi, se kterou Ap tvoří kovalentní spojení, ale o sekvenční závislosti v okolí ICL víme jen málo. Cílem této práce je prozkoumat pravděpodobnost vzniku Ap-ICL v závislosti na lokální sekvenci a biochemická charakterizace mechanismů vedoucí k jeho opravě. Bylo ukázáno, že kovalentní spojení Ap-ICL je štěpeno endonukleasou 8-like III (NEIL3) v eukaryotech a jeho blízký ortholog v bakteriích je formamidopyrimidin-DNA glykosylasa (Fpg), DNA opravný enzym s...

Abasic sites (Ap site, from apurinic/apyrimidinic) are one of the most common lesions generated in DNA by spontaneous base loss or DNA repair processes. There are two equilibrating forms of an Ap site - ring-open aldehyde and cyclic hemiacetal. Ring- opened aldehydes are reactive electrophilic groups capable of formation covalent adduct with nucleophilic sites in DNA. DNA interstrand cross-link (ICL) resulting from the Ap sites is formed spontaneously as a covalent bond between ring-open aldehyde and amin group of adenin residue in the opposite strand of double stranded DNA. ICLs block DNA replication and transcription. The formation of Ap site derived ICL is relatively long process taking several hours. We assume that the ring-opening of an abasic site is the rate-limiting step in the formation of the thermodynamic ICL. However, formation, stability and DNA repair of Ap-ICL are still poorly understood processes. Here, I have set up mechanistic in vitro experiments to reveal and calculate the probability of Ap-ICl formation in vivo. In more detail, I study the rates of formation of Ap-ICLs in the sequence context of neighbouring nucleotides of freshly formed covalent bond of ICL. I focus on sequence preference, the influence of AT/ GC rich regions and the length of oligonucleotides. I have...