Development of analytical tools for quantification and screening for inhibitors of glutamate carboxypeptidases II and III

Abstract

Glutamát karboxypeptidasa II (GCPII), známá také jako prostatický specifický membránový antigen (PSMA), je membránová metalopeptidasa exprimovaná zejména na buňkách karcinomu prostaty (PCa). Látky cílící GCPII pro zobrazování a léčbu PCa jsou ve vývoji a ukazují nadějné výsledky v pokročilých fázích klinického testování. Některé studie ukázaly, že GCPII by mohla být využita také jako krevní marker PCa, což ale zatím nebylo potvrzeno kvůli absenci metod vhodných pro přesnou detekci GCPII v krvi. GCPII je exprimována také v mozku, kde štěpí inhibiční N-Acetyl-α-L-aspartyl-L- glutamát (NAAG) na excitační L-glutamát a inhibice GCPII je neuroprotektivní ve zvířecích modelech několika neuropatií. Silné inhibitory GCPII byly nalezeny pomocí racionálního vývoje, ale všechny vykazují nedostatečnou biodostupnost aby mohly být využity v klinické praxi. Nalezení nových strukturních motivů je tedy nezbytné, nicméně zatím nebyla vyvinuta žádná metoda vhodná pro účinné testování inhibitorů GCPII. V mozku se nalézá také málo prozkoumaná glutamát karboxypeptidasa III (GCPIII), která také štěpí NAAG. Její studium je tak nutné pro pochopení funkce GCPII a pro cílení GCPII v medicíně. V této práci jsme se zaměřili na vývoj nových metod pro kvantifikaci obou enzymů a pro hledání jejich inhibitorů. Nejprve jsme vyvinuli...

Glutamate carboxypeptidase II (GCPII) usually called prostate specific membrane antigen (PSMA) is membrane bound metallopeptidase expressed mainly in prostate carcinoma (PCa). Agents targeting GCPII suitable for both imaging and treatment of PCa are in development and they show promising results in advanced clinical trials. Some studies showed that GCPII may serve also as PCa blood serum marker, but this has not been validated due to the lack of methods suitable for accurate detection of GCPII in human blood. Moreover, GCPII is also expressed in brain, where it cleaves inhibitory N-acetyl-α-L- aspartyl-L-glutamate (NAAG) to release excitatory L-glutamate and GCPII inhibition has been shown to be neuroprotective in animal models of several neuropathies. Tight binding inhibitors of GCPII have been identified by rational design, but all have poor bioavailability and thus cannot be used in clinics. Identifying new scaffolds by 'brute force' screening methods is thus essential; however, no such method for GCPII has been developed so far. Glutamate carboxypeptidase III (GCPIII) is also expressed in brain and cleaves NAAG. It is thus an important protein for understanding of GCPII function as well as GCPII targeting in medicine. Here, we focused on development of novel methods for quantification of both...