Extrakce nukleotidů z rostlinné matrice a jejich stanovení iontově výměnnou vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií

Abstract

In this thesis chromatographic conditions for the HPLC analysis of ribonucleotides AMP, ADP and ATP were optimized. For their separation chromatographic column, Nucleogel SAX 1000-8, 50 x 4,6 mm, from the German company Marcherey-Nagel was used. The mobile phase of a 0,2 mol/L solution of KH2PO4, its pH was adjusted with 1mol/L with potassium hydroxide to pH = 5,00. As the most suitable flow rate was selected 1,0 mL/min. The analysis was conducted using an isocratic elution. Detection was conducted by a DAD detector at a wavelength of λ = 260 nm. Substances were eluted in the following order AMP (tr = 0,911 min), ADP (tr = 1,667 min) and ATP (tr = 7,262 min). The total analysis time of the mixture of standards, under the conditions mentioned above, lasted for 10 minutes. For the extraction of adenosine-5-ribonucloetides the real matrix frozen and lyophilized leaves of tobacco virginia (Nicotiana tabacum L.) have been used. Two methods of extraction were applied. The first procedure was based on the extraction of AMP, ADP and ATP from the leaves of the tobacco plant by boiling deionized water. In the second method 0,07 mol/L HClO4 for the extraction instead of deionized water was used. Keywords: HPLC, adenosine ribonucleotides, AMP, ADP, ATP, tobacco virginia

V této diplomové práci byly optimalizovány chromatografické podmínky pro HPLC analýzu ribonukleotidů AMP, ADP a ATP. Pro separaci byla využita chromatografická kolona Nucleogel SAX 1000-8, 50 x 4,6 mm, od německé firmy Marcherey-Nagel. Mobilní fázi tvořil roztok KH2PO4 o koncentraci 0,2 mol/L, jehož pH bylo upraveno 1mol/L hydroxidem draselným na hodnotu pH = 5,00. Jako nejvhodnější průtoková rychlost byl zvolen 1,0 mL/min. Analýza probíhala s využitím isokratické eluce. Detekce byla provedena DAD detektorem při vlnové délce λ = 260 nm. Látky byly eluovány v pořadí AMP (tr = 0,911 min), ADP (tr = 1,667 min) a ATP (tr = 7,262 min). Celková doba analýzy směsi standardů, za výše zmíněných podmínek, trvala 10 minut. Pro extrakci adenosin-5'-ribonukloetidů z reálné matrice byly použity mražené a lyofilizované listy tabáku virginského (Nicotiana tabacum L.). Byly využity dvě metody extrakce. První postup byl založen na extrakci AMP, ADP a ATP z listů rostliny tabáku vařící deionisovanou vodou. Druhá metoda využívala k extrakci, místo deionisované vody, 0,07mol/L HClO4. Klíčová slova: HPLC, adenosinové ribonukleotidy, AMP, ADP, ATP, tabák virginský