Nastavenie skríningových metód na nájdenie nových regulátorov aktivity fosfoglykolát fosfatázy.

Abstract

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology & Toxicology Student: Eva Troppová Supervisor: PharmDr. Marie Vopršalová, CSc. Specialized supervisor: Prof. Dr. Antje Gohla Title of diploma thesis: Establishment of screening methods to find new regulators of the activity of phosphoglycolate phosphatase This work deals with the siRNA-based genomic screening for the modification of phosphoglycolate phosphatase (PGP) activity. 235 proteins were affected by transient transfection of siRNAs in vitro. Each siRNA was used in duplicates and the control was carried out by two control siRNAs. After downregulation of protein by siRNA PGP activity was evaluated, whether any modifications of PGP activity have occurred. PGP was the main research target. The main goal of this study before the screening was to set up a method, to create a reliable protocol. The whole study was 96 plate well. It was necessary to find the right conditions to measure PGP activity in two cell types (HEK AD 293 and Hep G2). Subsequently, optimal conditions were set up to influence expression of the protein. The method was optimalized using PGP siRNAs and 2 types of transfection reagents were tested. During our study the following methods were used: PGP activity assay, Bicinchoninic acid...

Univerzita Karlova v Prahe Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakológie a toxikológie Študentka: Eva Troppová Školitel: PharmDr. Marie Vopršalová, CSc. Školitel špecialista: Prof. Dr. Antje Gohla Názov diplomovej práce: Nastavenie skríningových metód na nájdenie nových regulátorov aktivity fosfoglykolát fosfatázy Táto práca sa zaoberá genómovým skríningom založeným na používaní nukleových kyselín pod označením siRNA. Tieto nukleové kyseliny sú použité na zistenie zmien v aktivite fosfoglykolát fosfatázy (PGP). 235 proteínov bolo ovplyvnených prechodnou transfekciou pomocou siRNA in vitro. Po downregulácii proteínu pomocou siRNA boli hodnotené zmeny v aktivite PGP. PGP bol hlavným záujmom tohoto výskumu. Hlavným cieľom tejto štúdie pred samotným skríningom bolo nastavenie metódy. V prvom rade bolo potrebné nájsť správnu koncentráciu buniek, v ktorých lyzáte bola meraná aktivita PGP. Používali sa bunkové línie typu HEK AD 293 a Hep G2. Následne boli nastavené optimálne podmienky pre ovplyvnenie expresie proteínov pomocou siRNA. Metóda sa optimalizovala s použitím PGP siRNA a testovali sa dva typy transfekčných činidiel. Celá štúdia sa konala vo formáte 96 miestnej mikrotitračnej platničky. Pre dané účely boli použité nasledujúce metódy: test PGP aktivity, test bicinchonínovej kyseliny...