Molekulárně biologický průkaz Pneumocystis carinii pomocí real-time PCR

Abstract

Pneumocystis carinii is an opportunistic pathogen, which often causes fatal pneumonia in patients under immunosuppressed or immune deficient conditions due to AIDS, cancer chemotherapy, or immunosuppressive therapy for organ transplantation. Different techniqes of microscopy and a nested polymerase chain reaction (PCR) are widely used for detection of this opportunistic fungus. But these methods are less sensitive and time-consuming. We focused our attention on the level of specific DNA by a quantitative PCR technique. This procedure has the advantage of greater precision and more objectivity. In this report we describe a real-time PCR assay suitable for use with the LightCycler system. We were successful in implementation and optimalization of quantitative real-time PCR for Pneumocystis carinii. We have reached sensitivity 1000 copies of DNA Pneumocystis carinii /ml. We have set a limit of detection to be 50 copies of DNA Pneumocystis carinii /ml. Real-time PCR procedure was optimized and validated in laboratory of molecular biology of Department of clinicall biochemistry and diagnostics of Fakultni Nemocnice in Hradec Kralové. A standard routine was established to be utilized in general practice

Pneumocystis carinii je oportunní patogen, který způsobuje často smrtelnou pneumónii u pacientů pod imunosupresivní léčbou, u pacientů s imunitním deficitem (AIDS), u léčených chemoterapií, nebo u pacientů pod imunosupresivní léčbou z důvodu orgánové transplantace. Pro diagnostiku této oportunní houby se nejčastěji užívá různých mikroskopických technik a nested PCR. Ale tyto metody jsou méně citlivé a časově náročnější. My jsme se zaměřili na kvantifikační metodu real-time PCR. Tato metoda je vysoce precizní a mnohem objektivnější. V této práci popisujeme real-time PCR metodu pro detekci P. carinii vhodnou pro LightCycler systém. Zavedli a optimalizovali jsme kvantitativní metodu real-time PCR pro P. carinii. Pro kvantifikaci jsme použili primery z oblasti genu rRNA P. carii. Mez citlivosti jsme stanovili na 1000 kopií DNA/ml a mez detekce na 50 kopií DNA /ml. Real-time PCR je optimalizována a validována v laboratoři molekulární biologie Ústavu klinické biochemie a diagnostiky FN Hradec Králové. Byl vytvořen standardní operační postup pro praktické užití