Příprava savčích vektorů kódujících vybrané aldo-ketoreduktasy

Abstract

1 Abstrakt Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Daniel Herbolt Školitel: RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. Název diplomové práce: Příprava savčích vektorů kódujících vybrané aldo-ketoreduktasy Aldo-ketoreduktasy 1B1, 1B10 a 1C1 (AKR1B1, AKR1B10, AKR1C1) jsou NADPH-dependentní enzymy metabolizující celou řadu substrátů obsahujících karbonylovou skupinu. Tyto enzymy z nadrodiny aldo-ketoreduktas zprostředkovávají redukci endogenních látek, jako např. steroidních hormonů a cukrů, stejně tak jako mnoha různých xenobiotik a léčiv. Mimo svých fyziologických rolí se významnou měrou podílí na genezi několika závažných onemocnění (např. rakovina, diabetes aj.). Inhibice AKR1B1, AKR1B10 a AKR1C1 je považována za slibný terapeutický přístup pro léčbu těchto onemocnění. Cílem předkládané práce bylo připravit savčí vektory kódující AKR1B1, AKR1B10 a AKR1C1. Prvními kroky bylo navržení primerů a amplifikace cDNA klonovaných enzymů. Primery nesly sekvenci rozpoznávanou restrikčními endonukleasami přítomnými v multiklonovacím místě pCI plasmidu, což umožnilo vytvoření lepivých konců pomocí restrikce a následné spojení insertu a plasmidu za využití ligace. Připravené vektory byly transformovány do bakterií Escherichia coli HB101. U vybraných kolonií byla ověřena...

1 Abstract Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Daniel Herbolt Supervisor: RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. Title of diploma thesis: Preparation of mammalian vectors encoding selected aldo-keto reductases Aldo-keto reductases 1B1, 1B10 and 1C1 (AKR1B1, AKR1B10, AKR1C1) are NADPH-dependent enzymes metabolizing a broad spectrum of carbonyl-bearing substrates. These enzymes from the superfamily of aldo-keto reductases mediate the reduction of endogenous compounds such as hormones and sugars as well as various xenobiotics and drugs. Beside their physiological roles, they significantly participate in the genesis of severe diseases (e.g. cancer, diabetes etc.). Inhibition of AKR1B1, AKR1B10 and AKR1C1 is accepted as promising therapeutic approach for the treatment of these diseases. The goal of the present work was to prepare mammalian vectors encoding AKR1B1, AKR1B10 and AKR1C1. Primer design and cDNA amplification were the first steps. Primers contained the sequence recognized by restriction endonucleases present in the multicloning site of the pCI plasmid which allowed for the generation of cohesive ends and the consequent joining of insert with plasmid by ligation. Prepared vectors were transformed into Escherichia coli HB101 bacteria....