Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C4

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Kateřina Kosánová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C4. AKR1C4 je jedním ze čtyř lidských enzymů podrodiny aldo-ketoreduktas AKR1C. Jde o monomerní cytosolický protein o velikosti 323 aminokyselin exprimovaný v játrech. Hraje významnou roli jak v metabolismu endogenních, tak i exogenních látek. Podílí se na metabolizaci steroidních hormonů a žlučových kyselin a nejrůznějších léčiv jako např. tibolonu nebo naltrexonu. Hraje roli i v aktivaci některých kancerogenních látek, jako jsou PAH. cDNA enzymu byla dodána v buňkách E. coli DH10B, vložená do vektoru pDNR-LIB. Po rozbití buněk a izolaci plasmidu byla kódující sekvence namnožena pomocí PCR. Následně byla díky štěpícím místům pro Nde I a Xho I endonukleasy, které byly součástí primerů pro PCR, zaligována do vektoru pET-28b. Takto připravený rekombinantní plasmid byl transformován pomocí tepelného šoku do buněk E. coli HB101. Po svém namnožení byl ligovaný plasmid transformován do buněk BL21. Upravené buňky BL21 byly využity k expresi proteinu. Pro indukci overexprese byl použit IPTG. Čistý rekombinantní protein AKR1C4 se získal pomocí ÄKTA purifikace na chelatačních...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Kateřina Kosánová Supervisor: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Title of diploma thesis: Cloning, expression and purification of human AKR1C4. AKR1C4 is one of four enzymes in men belonging to subfamily of aldo-keto reductases AKR1C. It is monomeric cytosolic protein with length of 323 amino acids expressed in liver. It plays an important role both in metabolism of endogenous and exogenous substances. It is involved in the metabolism of steroid hormones and bile acids and many drugs, for example tibolone and naltrexone. It also plays a role in activation of some cancerogenic substances, e.g. PAHs. cDNA of enzyme was delivered in cells of E. coli DH10B, in pDNR-LIB vector. After lysis of cells and isolation of plasmid, the coding sequence was amplified by PCR. Afterwards it was ligated into vector pET-28b, thanks to added restriction sites for Nde I and Xho I endonucleases in designed PCR primers. The recombinant plasmid prepared by this way was transformed by heat shock to cells E. coli HB101. After amplification of ligated plasmid it was transformed to E. coli BL21. Adjusted cells BL21 were used for expression of the protein. IPTG was used as induction reagent for overexpression. Pure...