Zavedení experimentálních technik pro přípravu rekombinantních enzymů na modelu CBR3

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Helena Reissová Školitel: prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název rigorózní práce: Zavedení experimentálních technik pro přípravu rekombinantních enzymů na modelu CBR3. Tato práce byla zaměřena na zavedení experimentálních technik pro přípravu rekombinantních proteinů. Jako modelový protein byla použita lidská karbonylreduktasa 3 (CBR3). Rekombinantní CBR3 je využívána v četných metabolických studiích a její struktura je již dobře popsána jak na úrovni sekvence aminokyselin tak i celého prostorového uspořádání. Bylo popsáno i několik jejích substrátů, ale stále ještě není dostatečně popsána a objasněna její fyziologická funkce a role v metabolismu endogenních látek a xenobiotik. Příprava rekombinantního proteinu vycházela z izolace plasmidu nesoucího jeho kódovou sekvenci (vektoru pOTB7), dále následovala polymerasová reakce (PCR) s vhodně navrženými primery obsahujícími restrikční místa pro vybrané endonukleasy. Produkt PCR byl ligován do amplifikačního vektoru (pCR® 2.1-TOPO® ), vektor byl namnožen v transformovaných kompetentních buňkách. Kódová sekvence byla z vektoru vyjmuta pomocí restrikčních endonukleas a následně subklonována do otevřeného expresního vektoru (pET-15b). Správnost...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Mgr. Helena Reissová Supervisor: prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Title of rigorous thesis: Implementation of experimental techniques for preparing of recombinant proteins on the model of CBR3. This study was focused on implementation of experimental techniques for preparing of recombinant proteins. As a model protein was used the human carbonyl reductase 3 (CBR3). The recombinant CBR3 is used for numerous metabolic studies and its structure is already well described on both amino acids sequence and structure levels. Several of its substrates have been described, but its physiological functions and its role in metabolism of endogenous substances and xenobiotics are still not sufficiently described. The preparation of the recombinant protein started from isolation of the plasmid carrying its code sequence (vector pOTB7), followed by the polymerase chain reaction (PCR) with appropriate primers containing restriction sites for the choosen endonucleases. The PCR product was ligated into the amplification vector (pCR® 2.1-TOPO® ) and the vector was multiplied in transformed competent cells. The code sequence was removed from the vector by using restriction endonucleases and subsequently was...