Využití kometového testu pro stanovení poškození DNA v průběhu protinádorové chemoterapie.

Abstract

Ve své práci jsem se zabývala měřením poškození DNA v lymfocytech izolovaných z periferní lidské krve během chemoterapeutické léčby. Pacientům s diagnózou bronchogenního karcinomu byla podávána kombinace derivátů platiny (cis- platina nebo karboplatina) a dalších chemoterapeutických látek (gemcitabin, paclitaxel nebo vinorelbin). Celá chemoterapie probíhá ve 4 cyklech. My jsme měřili poškození DNA během 1. a 3. cyklu a 3 týdny po posledním absolvovaném cyklu chemoterapie. Detekci poškození DNA jsme prováděli metodou comet assay pro její spolehlivost a přesnost. Lymfocyty byly izolovány z plné krve pomocí média LSM Lymphocyte a poté byla provedena alkalická verze kometového testu. Hodnotili jsme vznik jednořetězcových zlomů (SSB) a tvorbu křížových vazeb (ICL). Pro detekci křížových vazeb byly lymfocyty inkubovány v přítomnosti 200 µM styrenoxidu (SO). Inkubace periferních lidských lymfocytů s 200 µM SO vede k tvorbě zlomů v DNA a ke vzniku komet. Pokud jsou v DNA přítomné křížové vazby, alkalické rozplétání je blokováno a dojde ke snížení hodnoty % DNA v ohonu (% tail DNA). Komety byly poté barveny ethidium bromidem a analyzovány softwarem LUCIA Comet Assay. Počet jednořetězcových zlomů v DNA byl před započetím chemoterapie poměrně nízký, ihned po zahájení léčby však byl patrný nárůst tohoto typu...

We have monitored the DNA damage induced by tumor chemotherapy. The combination of platin derivate (cis-platine or carboplatin) and another chemotherapy agent (gemcitabin, paclitaxel or vinorelbin) was applied to patients with lung carcinoma. The whole chemotherapy includes 4 cycles. We have monitored the DNA damage in peripheral blood lymphocytes through the first and the third cycle of chemotherapy and 3 weeks after the last cycle of chemotherapy. For detection we have used comet assay which seems to be accurate and reliable method. Lymphocytes were isolated from whole blood through the medium LSM lymfocyte and then were processed by the alkaline version of the single cell gel electrophoresis. We have analysed single strand breaks (SSB) and interstrand cross links (ICL). For the measurement of ICL isolated lymphocytes were incubated in the presence of 200 µM of styrene oxide (SO) to degrade the DNA by inducing strand breaks. Incubation of peripheral blood lymphocytes with 200 µM SO leads to the formation of comets. If ICLs are present in the DNA, the alkaline unwinding of DNA is blocked and the % of DNA in tail is reduced. Comets were stained with ethidium bromide and then analyzed by the software LUCIA Comet Assay. The damage of DNA caused by SSB before the chemotherapy was relatively low and...