Analýza bioléčiv pomoci kapalinové chromatografii. Optimalizace přípravy vzorků.

Abstract

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Pavlína Kolečková Supervisor,consultant: Mgr. Maria Khalikova, CSc. Title of Diploma Thesis: Analysis of biopharmaceuticals by liquid chromatography. Optimalization of sample preparation. This diploma theses is focused on development and optimalization of prepared samples in acidic pH for peptide mapping at the same time with minimization creation of undesirabe peptide modifications during preparation. Within the method of optimalization there were prepared several samples which were different in preparation process, use of chemicals or enzymes and also different condition of incubation. Enzymes used for preparation of samples were trypsin, endoproteinase Lys-C, endoproteinase Glu-C, endoproteinase Asp-N and endoproteinase Sap-9. At diploma theses were also used commercially available sets for preparing samples in acidic pH and then results were compared. Samples were analyzed by UHPLC-UV and LC-MS methods. Results from LC- MS analysis were processed by proteomics softwares like FragPipe and Byonic (Protein Metrics), which could be evaluated processes for digestion and preparation of samples in acidic pH, described their advantages or disadvantages For the complete comparison and evaluation of the...

Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Pavlína Kolečková Školitel: Mgr. Maria Khalikova, CSc. Název diplomové práce: Analýza bioléčiv pomocí kapalinové chromatografie. Optimalizace přípravy vzorků Tato diplomová práce je zaměřena na vývoj a optimalizaci postupu přípravy vzorků v kyselém pH pro peptidové mapování současně při minimalizaci vzniku nežádoucích modifikací peptidu v průběhu přípravy. V rámci optimalizace postupu byly provedeny přípravy několika vzorků, které se lišily jak postupem přípravy, použitými chemikáliemi či enzymy, tak i rozdílnými podmínkami inkubace. Enzymy použité pro přípravu vzorků byly trypsin, endoproteináza Lys-C, endoproteináza Glu- C, endoproteináza Asp-N a endoproteináza Sap-9. V diplomové práci se také používaly komerčně dostupné soupravy pro přípravu vzorků v kyselém prostředí a výsledky byly porovnány. Vzorky byly analyzovány metodou UHPLC-UV a LC-MS. Výsledky z LC-MS analýzy se poté zpracovávaly pomocí proteomických softwarů jako FragPipe a Byonic (Protein Metrics) díky kterým, mohly být vyhodnoceny postupy pro štěpení a přípravu vzorků v kyselém pH, popsány jejich výhody a úskalí. Pro celkové porovnání a vyhodnocení nejlepších postupů pro přípravu vzorků pro peptidové mapovaní byla provedena příprava vzorků...