Stanovení oxidativního poškození DNA pomocí jednobuněčné gelové elektroforézy (kometový test)

Abstract

Oxidativní poškození buňky představuje jeden z nejčastějších typů poškození, které se týká všech buněčných komponent. Jeho následkem jsou oxidační změny struktury lipidů, proteinů a DNA. Na posledně jmenované jsme se zaměřili v této práci. Oxidační změny DNA ústí v změny v replikačním cyklu buňky, které se projevují např. karcinogenezí, mutagenezí či stárnutím buňky. Buňky jsou vybaveny reparačními mechanismy, díky kterým jsou schopny toto poškození efektivně opravovat a tak si zachovat životaschopnost. Oxidační poškození indukují různé faktory, např. volné kyslíkové radikály nebo UV záření, použité pro vyvolání oxidačních změn DNA v rámci této práce. Stanovit oxidativní poškození je možné různými metodami, nejčastěji se používá kometový test (Comet assay). Jde o významnou metodu používanou pro detekci jednořetězcových a dvojřetězcových zlomů DNA, detekci alkalilabilních míst, zjišťování křížových spojení DNA- protein, oxidačních a alkylačních poškození DNA. Pro vlastní stanovení je potřeba jen velmi málo buněk, což představuje jednu z velkých výhod této metody. Námi používaná modifikace kometového testu spočívá ve využití reparačních enzymů, které umožňují detekovat specifické oxidační poškození DNA. Používali jsme tři enzymy: endonukleázu III pro detekci oxidovaných pyrimidinů,...

The oxidative cell damage represents one of the most common type of damage, which concerns all cell components. It produces the oxidative modifications of lipid structure, proteins and DNA. We concentrated on the last one in this work. The oxidative changes result in modification of replication cell cycle, which are represented for example by carcinogenesis, mutagenesis or by cell aging. Cells are provided by repairing mechanism. Owing to this mechanism the cells are able to repair this damage and stay viable. The oxidative damage is induced by various factors, for example free oxygen radicals or UV radiation, which we used for producing oxidative damage of DNA in this work. It is possible to measure the oxidative damage by using different methods, the most common way is using the comet assay. It represents an important method used for detection of single and doublestrand breaks, for detection of alcali-labile sites, searching for DNA- DNA/DNAprotein cross-linking, oxidative and alkylate damage of DNA. Only a little number of cells are needed for the measurement, which is the most important advantage of this method. We also used the modification of comet assay. It means the application of the reparative enzymes, which are able to recognize the specific oxidative damage of DNA. We used three...