Klonování a exprese lidské karbonylreduktasy CR-1

Abstract

Purifikace plasmidu pOTB7 s kódovou sekvencí karbonylreduktasy 1 (CBR1) v buňkách Escherichia coli (E. coli) byla provedena metodou alkalické lýze. Sekvence CBR1 byla namnožena metodou polymerasové řetězové reakce (PCR) za přítomnosti navržených primerů. Levý primer obsahoval restrikční místo pro restrikční endonukleasu NdeI a pravý primer pro restrikční endonukleasu XhoI. Správnost výsledků prvního kroku byla potvrzena ověřením velikosti nasyntetizovaného fragmentu a následně restrikční analýzou pomocí restrikční endonukleasy BamHI. Takto připravená kódová sekvence CBR1 byla ligována do vektoru Topo, který byl dále následně transformován do kompetentních buněk E. coli. Po namnožení E. coli byl vektor Topo obsahující kódovou sekvenci CBR1 purifikován metodou alkalické lýze. Úspěšnost druhého kroku byla ověřena porovnáním velikosti cyklického vektoru Topo bez vloženého insertu a vektoru Topo s kódovou sekvencí CBR1 na agarózovém gelu a následnou restrikční analýzou pomocí restrikční endonukleasy BamHI. Posledním krokem byla subklonace kódové sekvence CBR1 z vektoru Topo do expresního vektoru pET15b.

The purification of pOTB7 plasmid containing coding sequence of carbonyl reductase1 (CBR1) in cells of Escherichia coli (E. coli) was done by alkali hydrolysis. The sequence of CBR1 was multiplied by polymerase chain reaction (PCR) and synthesized primers with restriction sites were used. The left primer contained sequence for restrictive endonuclease NdeI and the right primer for restrictive endonuclease XhoI. Validation of the first step was confirmed by size measurement of the synthesized fragment with following restrictive analysis realized by restrictive endonuclease BamHI. Prepared sequence CBR1 was cloned into Topo vector, which was transformed into the competent E. coli cells. Topo vector was purified by alkali hydrolysis after innidation of E. coli cells. The size of cyclic Topo vector without CBR1 and Topo vector with CBR1 coding sequence was verified on agar gel by restrictive endonuclease BamHI. This was the validation of the second step. Subcloning of coding sequence CBR1 from Topo vector to express vector pET15b was the last step.