Automatizace stanovení s využitím různých typů luciferázy

Abstract

Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Denisa Dobrovolná Školitel: Doc. PharmDr. Hana Sklenářová, Ph.D. Konzultant: prof. Manuel Miró Název diplomové práce: Automatizace stanovení s využitím různých typů luciferázy Cílem této diplomové práce byla optimalizace podmínek stanovení luciferázy pomocí metody sekvenční injekční analýzy. K optimalizaci metody byly využity dva typy luciferázy - luciferáza I. typu a luciferáza II. typu. Při analýze byly použity dvě rozdílné průtokové cely detektoru lišící se objemem a optickou dráhou - první průtoková cela s objemem 100 µl, optickou dráhou 3x3 mm a druhá cela s objemem 120 µl a optickou dráhou 5x5 mm. Optimalizovány byly parametry měření - především průtoková rychlost, akumulační čas, čas cyklu měření a citlivost detektoru. Metoda byla nejprve testována pomocí nepřímého luminolového systému pro optimalizaci nastavení fluorescenčního detektoru a podmínek reakce. Nejlepších hodnot bylo dosaženo při měření s průtokovou celou o objemu 120 µl a optické dráze 5x5 mm, kde byla zaznamenána lepší opakovatelnost měření. Optimalizace měření pokračovala dále pomocí této průtokové cely stanovením luciferázy I. typu - nesekretované a následně i luciferázy II. typu - sekretované. V důsledku stále nevyhovující...

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Denisa Dobrovolná Supervisor: Doc. PharmDr. Hana Sklenářová, Ph.D. Consultant: prof. Manuel Miró Title of diploma thesis: Automation of determination using different types of luciferase The aim of this diploma thesis was optimization the assay conditions by using sequential injection analysis. Two types of luciferase were used to optimize the method-type one and type two. Two different flow cells with different volume and optical path were used - the first flow cell with volume of 100 µl and 3x3 mm optical path and the second flow cell with volume of 120 µl and 5x5 mm optical path. The parameters of measurement were optimized - especially flow rate, accumulation time, cycle time and detector sensitivity. The method was first tested using an indirect luminal system to optimize fluorescence detector settings and reaction conditions. The best results were obtained with the flow cell with the volume of 120 µl and 5x5 mm optical path. Better measurement repeatability was observed using this flow cell. The measurement optimization continued using this flow cell by determining type one - non-secreted luciferase, and subsequently type two - secreted luciferase. Due to unsatisfactory repeatability and...