HPLC hodnocení L-tryptofanu a jeho metabolitů v biologickém materiálu

Abstract

Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické chemie a farmaceutické analýzy Kandidát: Kateřina Málková Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Petr Kastner, Ph.D. Název diplomové práce: HPLC hodnocení L-tryptofanu a jeho metabolitů v biologickém materiálu Tématem diplomové práce bylo vyvinutí optimalizovaných podmínek pro stanovení L-tryptofanu a jeho metabolitů (L-kynurenin, kyselina kynurenová, serotonin, kyselina 5-hydroxyindol-3-octová, melatonin) pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Separace probíhala na silikagelové koloně Kinetex EVO C18 (100A, 150 × 3 mm, 5 μm) s předkolonou OPTI-GUARD 1 mm C18 za použití spektrofotometrické a fluorimetrické detekce. Výchozí parametry detekce uvedené v metodě byly nastavené pro kynurenin (absorbance při 369 nm, 227 nm a fluorescenční detekce Ex: 369 Em: 475). Detekční a eluční parametry metody byly dále optimalizovány dle přidávaných analyzovaných látek na základě jejich individuálních UV a fluorescenčních spekter. Byly zkoušeny různé mobilní fáze, různá pH tlumivých roztoků. Výsledná mobilní fáze se skládala ze dvou složek:  mobilní fáze A: voda + octanový tlumivý roztok 0,1 M; pH 4,5; methanol v poměru 97:3  mobilní fáze B: methanol. Byla využita eluce gradientová. Průtoková rychlost mobilní fáze byla 0,5 ml/min....

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmaceutical Analysis Candidate: Kateřina Málková Supervisor: PharmDr. Petr Kastner, Ph.D. Title of thesis: HPLC evaluation of L-tryptophan and its metabolites in biological material The purpose of this thesis was to develop optimized conditions for determination of L-tryptophan and its metabolites (L-kynurenine, kynurenic acid, serotonin, 5-hydroxyindole-3-acetic acid, melatonin) using high performance liquid chromatography. Separation was achieved by a silica gel column Kinetex EVO C18 (100A, 150 × 3 mm, 5 μm) with guard column OPTI-GUARD 1 mm C18 using spectrophotometric and fluorimetric detection. Initial parameters of detection mentioned in the method were for kynurenine (absorbance at 369 nm, 227 nm and fluorescence detection Ex: 369 Em: 475). Detection and elution parameters of the method were further optimized for subsequently added analysed substances on the basis of their individual UV and fluorescence spectra. Different types of mobile phase, different pH of buffer were examined. The finally mobile phase consisted of two components:  mobile phase A: water + acetate buffer 0,1 M; pH 4,5; methanol in a ratio 97:3  mobile phase B: methanol. The separation was performed by gradient...