Optimalizace exprese fotoafinitních proteinových nanosond lidských strukturních proteinů zubní skloviny

Abstract

Zubní sklovina (enamel) je nejtvrdší tkáň těla obratlovců. Je tvořena evolučně vysoce konzervovaným biomineralizačním procesem, který je řízen proteiny mezibuněčné hmoty (extracelulární matrix). Amelogenin (AMEL) a ameloblastin (AMBN) jsou hlavními proteiny a zároveň klíčovými prvky pro správnou tvorbu zubní skloviny. Současně slouží jako molekuly buněčné adheze, které regulují proliferaci a diferenciaci ameloblastů (buněk podílejících se na tvorbě zubní skloviny). Protože AMBN i AMEL patří do rodiny vnitřně neuspořádaných proteinů (IDP, z angl. intrinsically disordered protein), je velice složité najít metodiku umožňující studovat jejich strukturu a molekulární mechanismus působení. Tato bakalářská práce se zabývá optimalizací přípravy fotoaktivovatelných proteinových "nanosond" studovaného ameloblastinu a amelogeninu pomocí rekombinantní exprese v E. coli s inkorporovaným fotoaktivovatelným analogem aminokyseliny (methionin, leucin). Takto připravené proteinové "nanosondy" budou sloužit ke studiu protein-proteinových interakcí v roztoku a k objasnění strukturně funkčních vztahů lidských proteinů zubního enamelu (ameloblastin a amelogenin). Klíčová slova: Zubní sklovina Ameloblastin Amelogenin Fotoaktivovatelné proteinové "nanosondy" Hmotnostní spektrometrie

Dental enamel is the hardest tissue of the body. It is formed by an evolutionarily highly conserved biomineralization process that is controlled by proteins of extracellular matrix. Amelogenin (AMEL) and ameloblastin (AMBN) are key element of the correct enamel formation. Simultaneously the proteins serve as a cell adhesion molecule that regulates proliferation and differentiation of ameloblasts (the cells involved in dental enamel formation). AMEL and AMBN belong to the family of intrinsically disordered proteins (IDPs) therefore it is very difficult to find a methodology for studying the structure and action of molecular mechanism. This bachelor's thesis is aimed at optimization of preparation process of photolabile protein "nanoprobes" of ameloblastin and amelogenin using recombinant expression in E. coli by incorporation of the photolabile analogs of amino acids (methionine, leucine). The prepared protein " nanoprobes " will be used to study protein-protein interactions in solution and to elucidate the structure-function relationships of human dental enamel proteins (ameloblastin, amelogenin). (In Czech) Keywords: Dental enamel Ameloblastin Amelogenin Photolabile protein "nanoprobes" Mass Spectrometry