Značení T buněk bimodální kontrastní látkou pro studium mrtvice in vivo

Abstract

Mrtvice je závažné mozkové poranění, které může mít za následek náhlou smrt nebo trvalé neurologické poškození. V současnosti je k dispozici jediná účinná léčba pomocí tkáňového aktivátoru plasminogenu. Jedním z nových potenciálních cílů léčby jsou T buňky. Ačkoliv mnohé studie přisuzují úlohou T buněk v patogenezi ischemické mozkové příhody, množství i časový průběh infiltrace všech podtypů T buněk do místa mozkové léze není zcela znám. Výzkum v této oblasti je limitován nedostatkem metod vhodných pro in vivo sledování buněk. Z tohoto důvodu bylo cílem této práce vytvořit metodu pro značení T buněk MRI kontrastní látkou za účelem sledování distribuce T buněk pomocí in vivo MRI u myší s indukovanou ischemií. T buňky byly izolovány z C57/BL6 myšího kmene ve dvoukrokovém izolačním protokolu pomocí gradientové centrifugace a magnetické separace s 97% výtěžkem. Izolované buňky byly značeny kontrastní látkou Molday ION Rhodamine B o koncentraci 100 μg Fe/mL. Úspěšnost značení po 17-ti hodinách inkubace byla vyšší než 99 %. Značené buňky byly kultivovány s CD3 a CD28 protilátkami. Viabilita značených T buněk byla 74 % v porovnání s 83 % viabilitou neznačených buněk. Označené T buňky byly zobrazeny pomocí fluorescenční mikroskopie a magnetické rezonance. Mrtvice u myší byla indukována okluzí střední...

Stroke is a serious brain injury, which causes sudden death or terminates in permanent neurological disability. Nowadays, tissue plasminogen activator (tPA) is used as the only effective treatment of stroke. One of the potential targets for novel therapy are T cells. Even though the explicit role of T cells in the pathogenesis of brain injury, amounts and timing of all T cell subtypes infiltrating into brain during the stroke still needs further investigation. The research in this field is complicated by the lack of efficient methods for in vivo cell tracking. Therefore the aim of this thesis was to develop a method of T cells labelling by MRI contrast agent in order to investigate T cells distribution in ischemic mice model using in vivo MR imaging. T cells were isolated from C57/BL6 mice in two step isolation protocol using gradient centrifugation and magnetic separation with the efficiency of 97 %. The isolated cells were labelled with 100 μg Fe/mL of Molday ION Rhodamine B contrast agent. The labelling efficiency after 17 hours of cells incubation was higher than 99 %. The labelled cells were cultured with CD3 and CD28 antibodies resulting into the 74 % viability of labelled T cells compared to 83 % viability of non labelled T cells. The labelled T cells were visualized by fluorescent...