Bioinformatic evaluation of mass spectrometric data obtained by analysis of proteins modified by reactive oxygen species

Abstract

The field of structural mass spectrometry (MS) is a rapidly developing area comprising of many versatile techniques for the characterisation of biomolecules under native or near-native conditions. Among them, reactive radical labelling represents a promising approach, delivering insight into the conformational adjustments and biomolecular dynamics. Specifically, reactive oxygen species are capable of providing snapshots of the solvent-accessible regions of the studied system. Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) represents a powerful and accessible platform for protein footprinting, but the complexity of FPOP data presents significant challenges in bioinformatic analysis. This thesis aims to contribute to overcoming these difficulties by investigating the important aspects of FPOP data evaluation and proposing a novel FPOP workflow. In the first part of this work, different identification frameworks for the analysis of the FPOP data were evaluated. A detailed comparison between two widely used search engines, Mascot and PEAKS, was conducted to assess their performance in identifying modified peptides. The search engines were compared in their consistency across replicates and the confidence in reliability of the modification site assignment. Next, the thesis explored the potential of...

Strukturní hmotnostní spektrometrie je dynamicky se rozvíjející oblastí, která zahrnuje mnoho všestranných technik pro charakterizaci biomolekul v podmínkách blízkým jejich přirozenému prostředí. Jednou z těchto technik je značení pomocí reaktivních radikálů, jenž umožňuje studovat konformační a interakční dynamiku proteinů. Reaktivní formy kyslíku jsou díky své rychlosti značení schopné poskytnout "snímek" oblastí dostupných rozpouštědlu. Rychlá fotochemická oxidace proteinů (z anglického "Fast Photochemical Oxidation of Proteins - FPOP) je výkonná a dostupná metoda pro studium struktury proteinů, ale složitost FPOP dat ztěžuje následnou analýzu a interpretaci. Cílem této práce je přispět k překonání těchtopotíží, a to zaměřenímse na aspektydůležité provyhodnocení FPOP dat a navržením nového postupu pro zpracování FPOP analýz. V první části této práce byl zkoumán vliv použitého počítačového programu pro prohledávání hmotnostně-spektrometrických dat na výsledky FPOP analýz. Dva široce používané programy, Mascot a PEAKS, byly porovnány z hlediska jejich schopnosti identifikovat modifikované peptidy. Byla posouzena jejich konzistence napříč replikáty a jejich spolehlivost přiřazení modifikace ke konkrétní pozici v sekvenci peptidu. Dále se práce zaměřila na využití datově-nezávislého sběru dat pro...