Izolace bakteriálního flagelinu jako imunogenu pro přípravu protilátek pro pacienty s cystickou fibrosou

Abstract

Cystická fibróza (CF) je autozomálně recesivní onemocnění způsobeno mutacemi v CFTR genu. Důsledkem této mutace je špatná funkce chloridového kanálku tvořeného CFTR proteinem. Díky této abnormalitě se sníží či ztratí funkce transportu chloridových iontů a tím dojde k utvoření hlenu nazývaného mukus. Mukus se nejčastěji utváří v plicích a je ideálním prostředím pro patogenní bakterie, jako například Pseudomonas aeruginosa (PA). Pseudomonas aeruginosa je aerobní, gramnegativní, podmíněný patogen, vyskytující se u pacientů se sníženou imunitou či právě u pacientů s CF, kteří jsou často hospitalizováni v nemocnici. Obsahuje jeden polární bičík, jehož vlákno je mimo jiné složeno z proteinu flagelinu. Právě bičík je jedním z nejdůležitějších virulentních faktorů bakterie PA. Tato práce je zaměřena na izolaci flagelinu z bičíku bakterie PA, který poslouží jako antigen pro přípravu profylaktických protilátek pro pacienty s CF. Flagelin byl izolován pomocí čtyř metod založených na různých kombinacích centrifugačních a precipitačních kroků. Tyto publikované metody bylo třeba optimalizovat tak, aby se podařilo izolovat flagelin. Finální preparáty a meziprodukty byly analyzovány SDS-elektroforézou na polyakrylamidovém gelu a přítomnost flagelinu byla ověřována hmotnostní spektrometrií. Z výsledku vyplývá, že...

Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease caused by CFTR gene mutation. The consequence of this mutation is an improper function of the chloride channel consisting of CFTR protein. Due to this abnormality, the transport of chloride ions is either reduced or inhibited completely, which leads to a mucus secretion. Mucus is mostly created in the lungs and it is the ideal environment for pathogenic bacteria like Pseudomonas aeruginosa (PA). Pseudomonas aeruginosa is an aerobic, gram-negative conditioned pathogen occurring in patients with weakened immunity such as patients with CF, who are often hospitalized. PA has one polar flagellum which contains filament composed of a protein called flagellin. The flagellum is one of the most important virulence factors of PA bacteria. This thesis focused on the isolation of flagellin from Pseudomonas aeruginosa flagella. The isolated flagellin will serve as an antigen for the preparation of prophylactic antibodies for CF patients. The isolation of flagellin was carried out by four methods using combinations of precipitation and centrifugation. The published methods were optimized to achieve the isolation of flagellin. Final samples and intermediates were analyzed by SDS-electrophoresis on polyacrylamide gel and the presence of flagellin was verified...