Příprava a využití systému pro studium regulace genové exprese kvasinkových lineárních cytoplasmatických plasmidů

Abstract

O translaci lineárních cytoplasmatických plasmidů vyskytujících se u kvasinky Kluyveromyces lactis existují pouze velmi kusé informace. V současné době je poměrně dobře prozkoumán jejich transkripční aparát i celý transkriptom. Studium transkriptů lineárních plasmidů odhalilo velmi netypické uspořádání jejich 5ʼ konců, které obsahují netemplátovou polyadenylaci a postrádají N7 methylguanosinovou čepičku. Právě přítomnost této struktury na 5ʼ konci plasmudů specifických mRNA vyvolalo otázku iniciace translace. Tato práce se zabývala přípravou reportérového systému vhodného pro studium vlivu počtu netěmplátově přidaných adenosinů na 5ʼ konec mRNA lineárních plasmidů. Prvním krokem byla konstrukce duálního kvasinkového plasmidu nesoucího dva reportérové geny pod kontrolou dvou různých promotorů. Po jeho úspěšné konstrukci byla měřena aktivita promotorů TEF1 a PGK1, kdy se promotor TEF1 ukázal cca dvakrát silnější. Rovněž byl stanoven transkripční start obou promotorů. Druhým krokem byla konstrukce reportérového systému rovnou v kvasinkových plasmidech pGKL. Reportérové geny byly pod kontrolou dvou promotorů pocházejících z pGKL plasmidů iniciujících vznik trankriptů s různou strukturou. Po měření síly promotorů se ukázalo, že jejich síla je v porovnání s promotory TEF1 a PGK1 velmi nízká, až...

There is currently very few information about the transaltion of linear cytoplasmatic plasmids occured in yeast cells Kluyveromyces lactis. However, there is a relatively well developer information about their transcription apparatus. A study of transkript linear plasmids revealed an atypical organization at the 5ʼ end. Those ends contain nontemplate polyadenylation and they are missing the N7 methylguanosine hat. Because of the presence of this structure, which is localized at 5ʼend of plasmids specific mRNA, raised a question regarding the iniciation of the translation. The present thesis is focused on the preparation of reporter systém suitable for studying the influence of a number of the nontemplate adenosins, which were added at the 5ʼ ends of mRNA linear plasmids. The frist step was making a construction of dual yeast cell plasmids carring two reporters genes, which are under the controle of two different promoters. After a successfull construction, the aktivity of promoters TEF1 and PGK1 was measured, whereby the promoter TEF1 proved twice stronger. The transcription start site of both promotor was determined. The second step was the construction of a reporter system directly in yeast cell plasmid pGKL. Reporter genes were under the controle of two promoters originating from the pGKL...