Analysis of Src dynamics in cellular structures
Analýza dynamiky Src v buněčných strukturách
diplomová práce (OBHÁJENO)
Zobrazit/ otevřít
Trvalý odkaz
http://hdl.handle.net/20.500.11956/150936Identifikátory
SIS: 219298
Kolekce
- Kvalifikační práce [19613]
Autor
Vedoucí práce
Oponent práce
Rozbeský, Daniel
Fakulta / součást
Přírodovědecká fakulta
Obor
Buněčná a vývojová biologie
Katedra / ústav / klinika
Katedra buněčné biologie
Datum obhajoby
9. 9. 2021
Nakladatel
Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakultaJazyk
Angličtina
Známka
Výborně
Klíčová slova (česky)
Src, FRET, biosenzor, mikroskopie živých buněk, mNeonGreenKlíčová slova (anglicky)
Src, FRET, biosensor, live-cell imaging, mNeonGreenSrc kináza je klíčovým elementem mnoha signálních drah, které ovlivňují buněčné procesy jako diferenciaci, proliferaci, motilitu či migraci. Deregulace její aktivity je spojena s rozvojem rakoviny. Pochopení její funkce v buňce je tedy zásadní. Aktivita Src kinázy přímo koreluje s její konformací; v aktivním stavu zaujímá otevřenou konformaci, ve stavu inaktivním je v uzavřené konformaci, stabilizované intramolekulárními interakcemi. Detekce konformace Src kinázy tak může být použita ke sledování její aktivity. V této práci byl vylepšen biosenzor, detekující změnu konformace Src kinázy a založený na metodě FRET, a to použitím mNeonGreenu jako nového akceptorového fluoroforu v již existujícím designu. Vlastnosti nového senzoru byly porovnány se senzorem původním. Nový senzor je schopen detekovat konformační změny Src kinázy a lze ho stabilně exprimovat v buňkách. Analýza aktivity Src kinázy ve fokálních adhezích potvrdila zvýšenou aktivitu Src v těchto strukturách. Ačkoli nový biosenzor v porovnání s původním nevykazuje vyšší citlivost ke konfromačním změnám Src, stále se jedná o validní a užitečný nástroj pro studium aktivity Src kinázy, který je díky vyššímu jasu mNeonGreenu vhodnější pro mikroskopické experimenty. Klíčová slova: Src, FRET, biosenzor, mikroskopie živých buněk, mNeonGreen
Src kinase is a key element in many signaling pathways affecting cellular processes such as differentiation, proliferation, motility, or migration. Deregulation of its activity is associated with the promotion of cancer. Therefore, understanding its cellular function is vital. Src activity directly correlates with its structure; when Src is active, it adopts opened conformation, when inactive, it is in closed conformation stabilized by intramolecular interactions. Detection of the conformation can be used to analyze Src activity. In this thesis, conformation-sensitive FRET-based Src biosensor was improved using mNeonGreen as a new acceptor fluorophore in the existing design and the properties of the new biosensor were compared with the original Src biosensor. The new biosensor is able to detect changes in Src conformation and can be stably expressed in cells. Src activity in focal adhesion was analyzed and higher Src activity in these structures was confirmed. Although the new biosensor did not exhibit significantly better sensitivity to Src conformational changes, it still proved to be a useful tool to study Src activity, and mNeonGreens higher brightness makes it more suitable for microscopic experiments. Key words: Src, FRET, biosensor, live-cell imaging, mNeonGreen