Strukturní charakterizace intracelulární formy myšího Nkr-p1a proteinu.

Abstract

4 ABSTRAKT NK buňky jsou komponentou přirozeného imunitního systému, která je odvozena od lymfoidního progenitoru. Pomocí sofistikovaného receptorového repertoáru, jež exprimují na svém povrchu, se účastní obrany organismu proti patogenním, virem infikovaným nebo nádorovým buňkám. Současně produkují cytokiny, jejichž prostřednictvím pomáhají spoluutvářet i adaptivní imunitní odpověď. Tato práce je zaměřena na studium struktury rozpustné isoformy myšího receptoru mNkr-p1a, která byla v nedávné době na transkripční úrovni identifikována členem naší laboratoře a nese pracovní označení isoforma 2. Cílem práce bylo vyprodukovat protein mNkr-p1a iso2 v prokaryotickém expresním systému a provést jeho renaturaci a purifikaci in vitro. V další fázi byl získaný produkt analyzován metodami hmotnostní spektrometrie. Jí získané výsledky nás ovšem dovedly k určitým pochybnostem, zda náš protein v roztoku nabývá definovanou 3D strukturu a nejedná se pouze o artefakt. To bylo vyvráceno dalšími biofyzikálními metodami, nukleární magnetickou rezonancí a měřením cirkulárního dichroismu a dynamického rozptylu světla. Klíčová slova: NK buňky Receptor mNkr - p1a Krátká isoforma mNkr - p1a iso2 Alternativní sestřih Biosyntéza proteinů Produkce rekombinantních proteinů Purifikace proteinů Hmotnostní spektrometrie Disulfidové vazby...

NK cells are a component of innate immunity system, which is derived from lymphoid progenitor. By a sophisticated receptor repertoire, which is expressed on their surface, they provide a surveillance against pathogenic, virus infected or tumour cells. Simultaneously they produce cytokines, thereby are involved in adaptive immune response. This work is focused on the study of structure of mice soluble mNkr-p1a isoform. Recently this short isoform was identified at the transcriptional level by a member of our laboratory and it is designated as isoform 2. The aim was to produce mNkr-p1a iso2 protein in the prokaryotic expression system and to perform its renaturation and purification in vitro. In the next phase of work, the obtained product was analyzed by the mass spectrometry methods. Recieved results made us think about that our protein is in unfolded state. This assumption was refuted by following biophysical methods, nuclear magnetic resonance, circular dichroism and dynamic light scattering measurement. Keywords: NK cells Receptor mNkr - p1a Short isoform mNkr - p1a iso2 Alternative splicing Protein biosynthesis Recombinant protein production Protein purification Mass spectrometry Disulfide bond Chemical cross-linking NMR, CD, DLS 5