Vývoj a optimalizace separace oligonukleotidů s využitím nového přístupu recyklační HPLC

Abstract

1 Abstrakt Separace biologicky významných látek zahrnující proteiny, peptidy a nukleové kyseliny se v posledních letech staly významnou oblastí aplikací pro různé módy vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Jednou z nich je preparativní separace s cílem izolace čistých produktů syntézy oligonukleotidů. Tyto mají v oblasti současné vědecké i komerční sféry zcela zásadní význam. Hrají nezastupitelnou roli v podobě krátkých sekvencí (primerů či sond) pro celou řadu molekulárních metod zahrnujících polymerázovou řetězovou reakci (PCR), DNA sekvenování, detekci patogenů pomocí specifické hybridizace a podobně. Příprava dokonale přesných a čistých oligonukleotidů bývá často zcela zásadní pro úspěšnost těchto metod, proto velmi záleží na účinnosti izolace cílové sekvence od neúplných produktů syntézy či dalších nechtěných příměsí. Současné postupy zahrnují mimo jiné i preparativní chromatografii, avšak nezřídka kdy mívají standardně používané postupy nedostatečné rozlišení. Koncept recyklační chromatografie, kdy jsou analyty po výstupu z kolony navráceny zpět pro opakovaný průchod kolonou, a tím je zlepšeno jejich rozlišení, je znám od 60 let. V poslední době byl však představen zcela nový koncept, tzv. systému Repetto, kdy jsou segmenty separované směsi sekvenčně vraceny zpět na kolonu bez nutnosti průchodu...

1 Abstract Separation of biologically important substances such as proteins, peptides and nucleic acids, has become an important area of application for various modes of high-performance liquid chromatography in recent years. One of those applications is preparative chromatography for isolation of pure oligonucleotide synthesis products. Oligonucleotides are of fundamental importance in the field of contemporary scientific and commercial spheres. They play and irreplaceable role in the form of short sequences (primers or probes) for a variety of molecular methods including polymerase chain reaction (PCR), DNA sequencing, detection of pathogens by specific hybridization etc. The preparation of perfectly defined and pure oligonucleotides is often crucial for the success of these methods, so the efficiency of isolating the target sequence from incomplete synthesis products or other unwanted impurities is very important. Current procedures do not have sufficient enough resolution. The concept of recycling chromatography, where the analytes are returned to the column for repeated passage after leaving the column and thus their resolution is improved, has been known since the 1960s. Recently, however, a completely new concept was introduced, the so-called Repetto system, where segments of the separated mixture...