Meiotický efekt mutace genu MutS homolog 6 (Msh6) u dvou myších poddruhů

Abstract

Pro účely studia hybridní sterility byl v naší laboratoři vytvořen model založený na kmeni PWD/Ph (PWD) pocházejícího z divokých myší poddruhu M. m. musculus a běžně využívaném laboratorním kmeni C57BL/6J (B6) odvozených zvíce než 90% od poddruhu M. m. domesticus. Po křížení samice PWD a samce B6 získáme samčí potomky, kteří jsou sterilní. Hybridní samci F1 generace vykazují defekty v opravě asymetrických dvouvláknových DNA zlomů (DNA double-strand breaks, DSBs) iniciovaných společným působením proteinů SPO11 a PRDM9 v meiotické profázi I, přičemž dochází k poruchám synapse mezi homologními chromozomy vedoucí k zástavě spermatogeneze a samčí sterilitě. Tvorba dvouřetězcových zlomů a jejich následná oprava je předpokladem pro první meiotické dělení. Pracovní hypotéza vychází z poznatků založených na kvasinkovém modelu, kdy předpokládaný antirekombinační mechanismus mismatch repair genů Msh6 a Msh2 zamezuje opravu DSBs v místech DNA polymorfismů mezi homologními chromozomy během meiózy. Ačkoliv není znám přesný mechanismus antirekombinační funkce těchto dvou genů, na základě homologie systému oprav napříč organismy existuje silný předpoklad podobné funkce v myší meióze. V této práci byla využita řada různých metod. Se záměrem studie účinku delece genu Msh6 na meiotickou profázi I a zrání spermií byla...

To study hybrid sterility our laboratory uses mouse strains PWD/Ph (PWD), derived from Mus musculus musculus wild mice and the common laboratory strain C57BL/6J (B6) mostly of Mus musculus domesticus origin as a model. Crossing between PWD female and B6 male results in sterile male progeny. F1 hybrid males carry defects in the repair mechanisms of asymmetric double-strand DNA breaks (DSBs). Functional interplay of SPO11 and PRDM9 proteins in the meiotic prophase I is necessary for repairs. Its defect leads to incorrect synapse formation between homologous chromosomes, leading to halt in spermatogenesis and thus male sterility. The formation of DSBs and their subsequent repair is essential for first meiotic division. The working hypothesis stems from the findings in yeast model, where supposed antirecombinatorial mechanism of mismatch repair genes Msh6 and Msh2 prevents DSBs repairs during meiosis. Despite the functional mechanism of these two genes is not explicitly known, existence of similar repair system in mice is presumed. Variety of methods was implemented in this thesis. The effects of Msh6 deletion on meiotic prophase I and sperm maturation were performed by designing guide RNAs for CRISPR/Cas9 for creation of three knock-outs in B6 mice. The PCR was used to amplify regions adjacent to the...