Synthesis and studies of modified DNA: (i) development of DNA targeting molecular scissors and (ii) competitive enzymatic incorporation of base-modified nucleotides
Syntéza a studie modifikované DNA: (i) vývoj molekulárních nůžek cílících na DNA a (ii) kompetitivní enzymová inkorporace nukleotidů modifikovaných na bázi
dizertační práce (OBHÁJENO)
Zobrazit/ otevřít
Trvalý odkaz
http://hdl.handle.net/20.500.11956/120908Identifikátory
SIS: 170662
Kolekce
- Kvalifikační práce [19114]
Autor
Vedoucí práce
Oponent práce
Urban, Milan
Fojta, Miroslav
Fakulta / součást
Přírodovědecká fakulta
Obor
-
Katedra / ústav / klinika
Katedra organické chemie
Datum obhajoby
14. 9. 2020
Nakladatel
Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakultaJazyk
Angličtina
Známka
Prospěl/a
Klíčová slova (česky)
DNA, komplexy kovů, nukleotidyKlíčová slova (anglicky)
DNA, metal complexes, nucleotidesSouhrn V první části této práce byla vyvinuta série specifických umělých metalonukleáz (AMN), které konjugují sevřené fenanthrolinové měděné komplexy (Clip-Phen) s oligonukleotidy vytvářejícími triplex (TFO). Pro syntézu hybridů TFO-AMN bylo zkoumáno několik syntetických cest, přičemž všechny sdílely mědí katalyzovanou alkyn-azidovou cykloadici (CuAAC) jako klíčový krok. V důsledku toho byly připraveny stavební bloky pro enzymatickou nebo chemickou syntézu oligonukleotidů (ON) obsahujících klikací skupiny nebo již konjugované s ligandem Clip-Phen přes CuAAC. Byly navrženy a vyvinuty dva nové alkynyl modifikované nukleosid-5'-O-trifosfáty (dNTP), aby bylo dosaženo účinné polymerázové inkorporace klikacích alkynyl řetězců do ON a zároveň zvýšení účinnosti CuAAC reakcí na modifikované DNA. Byly také připraveny odpovídající 3'-O- fosforamidity, aby se pomocí chemické syntézy na pevné fázi vložily stejné alkynylové linkery do ON. AMN byla připojena na 5'- nebo 3'- koncích nebo uprostřed TFO úseku pomocí různých linkerů. Byla studována hybridizace všech syntetizovaných TFO s duplexem DNA obsahujícím cílovou sekvenci. Nakonec byla provedena rozsáhlá studie účinnosti štěpení a specificity konjugátů TFO-AMN vůči cílové DNA, přičemž se zkoumal vliv vlastností hybridů a reakčních parametrů. Ve druhé části této práce...
In the first part of this work, a series of site-specific artificial metallonucleases (AMNs) was developed conjugating clamped-phenanthroline (Clip-Phen) copper complexes to triplex- forming oligonucleotides (TFOs). Several synthetic routes were explored for the synthesis of the TFO-AMNs hybrids, all sharing a copper-catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) reaction as the key step. As a consequence, building blocks for enzymatic or chemical synthesis of oligonucleotides (ONs) containing clickable groups, or already conjugated to the Clip-Phen ligand via CuAAC, were prepared. Two new alkynyl-linked nucleoside-5'-O-triphosphates (dNTPs) were designed and developed in order to obtain an efficient polymerase incorporation of clickable alkynyl-tethers into ONs and, at the same time, enhance the efficiency of CuAAC reactions on modified DNA. The relative 3'-O- phosphormaidites were also prepared in order to insert the same alkynyl-linkers into ONs via solid-phase synthesis. The AMN was linked at the 5'- or 3'-ends or in the middle of the TFO stretch, using diverse likers. The hybridization of all the synthesized TFOs with a target DNA duplex was studied. Finally, an extensive study of cleavage efficiency and specificity of the TFO-AMN conjugates towards the target DNA was performed, exploring the...