Entropically driven cascade hybridization reactions for detection of microRNA
Entropicky řízené kaskádové hybridizační reakce pro detekci mikroRNA
diploma thesis (DEFENDED)
View/ Open
Permanent link
http://hdl.handle.net/20.500.11956/120889Identifiers
Study Information System: 208869
Collections
- Kvalifikační práce [19614]
Author
Advisor
Referee
Kožíšek, Milan
Faculty / Institute
Faculty of Science
Discipline
Biophysical Chemistry
Department
Department of Physical and Macromolecular Chemistry
Date of defense
8. 9. 2020
Publisher
Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakultaLanguage
English
Grade
Excellent
Keywords (Czech)
mikroRNA, detekce, hybridizační reakce, kaskádové reakce, fluorescenceKeywords (English)
microRNA, detection, hybridization reaction, cascade reaction, fluorescenceRostoucí význam miRNA molekul jakožto diagnostických biomarkerů vyvolává poptávku po vývoji nových kvantifikačních metod. Současné přístupy umoňující její kvantifikaci zpravidla vyžadují časově náročnou a nákladnou izolaci miRNA. V této práci navrhujeme nový detekční systém založený na zlatých nanočásticích modifikovaných oligonukleotidy (AuNP/DNA), který by mohl umožnit detekci a kvantifikaci miRNA v živých buňkách bez potřeby předchozí izolace. Tento kaskádový, entropicky řízený amplifikační systém poskytuje fluorescenční signál díky přítomnosti cílové miRNA. V této práci byla velikost citrátem stabilizovaných zlatých nanočástic stanovena dynamickým rozptylem světla a transmisní elektronovou mikroskopií. Povrchová modifikace AuNP byla provedena podle nedávno publikované "vymrazovací metody" a nanočásticový systém (AuNP/DNA) byl porovnán s analogickým DNA systémem bez přítomnosti AuNP v sérii fluorescenčních měření ukazujících kinetiku reakce a selektivitu k různým miRNA. Dále byly provedeny stabilitní experimenty v prostředí glutathionu a také DNA elektroforéza demonstrující složení vzorku během reakce. 42.31 ± 2.91 nm AuNP/DNA konstrukty průměrně obsahující 25 komplexů DNA na jednu zlatou nanočístici, vykazují v porovnání s analogickým DNA systémem až dvojnásobné reakční výtěžky a vyšší...
The emerging potential of miRNA molecules as diagnostic biomarkers calls for the development of a new quantification method. Current approaches usually require time-consuming and costly miRNA isolation for proper sample analysis. In this thesis, a new, isolation-free, oligonucleotide- modified gold nanoparticle (AuNP/DNA) system is proposed and designed for miRNA detection and quantification in living cells. This cascade, entropy-driven, and enzyme-free amplification system provides fluorescence signal upon selective interaction with the target miRNA. For this purpose, citrate-stabilized gold nanoparticles were synthesized, and their diameters were determined by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The AuNP/DNA conjugates were prepared following a recently published "freezing method". Their reaction kinetics with the target miRNA and selectivity to various miRNAs were compared with those of an analogous DNA system without AuNPs in a series of fluorescence measurements. Furthermore, stability experiments in glutathione environment were conducted, as well as DNA electrophoresis, demonstrating the mechanistic aspects of the reaction. The reaction yields and selectivity to target miRNA of 42.31 ± 2.91 nm AuNP/DNA constructs, containing approximately 25 DNA complexes per AuNP,...