Nová penicilin-G-acylasa z bakteriálního kmene Achromobacter sp.CCM 4824

Abstract

83 6. Závěr 1. Kultivací bakteriálního kmene Achromobacter sp. CCM 4824 v bioreaktoru byla získána biomasa s penicilinacylasovou aktivitou jako výchozí materiál pro purifikaci enzymu. Specifická aktivita biomasy měřená se substrátem penicilin G byla 19 U·g-1 sušiny. 2. Byla vyvinuta metoda purifikace nové PGA. Specifická aktivita purifikovaného enzymu byla kolem 30 U·mg-1 proteinu s celkovým výtěžkem kolem 10 % a stupněm přečištění kolem 300. 3. Bylo zjištěno, že purifikovaný enzym se skládá ze dvou nekovalentně spojených, nestejně velkých podjednotek α a β. Přesné molekulové hmotnosti obou podjednotek byly stanoveny pomocí hmotnostní spektrometrické analýzy: α = 27,02 kDa a β = 62,45 kDa. Molekulová hmotnost β-podjednotky přibližně odpovídá hmotnostem β- podjednotek známých PGA, naopak menší α-podjednotka svou molekulovou hmotností α-podjednotky známých PGA převyšuje přibližně o 3 kDa. 4. Pomocí nativní elektroforézy a izoelektrické fokusace bylo zjištěno, že purifikovaná PGA obsahovala dvě izoformy o izoelektrických bodech pI 8,0 a 8,2. Substrátová specifita obou izoforem byla stejná, proto byla směs izoforem považována za jeden enzym. 5. Nový enzym se od známých PGA odlišuje svojí substrátovou specifitou: hydrolyzuje téměř dvojnásobnou rychlostí semisyntetická β-laktamová antibiotika, která mají na...

83 6. Závěr 1. Kultivací bakteriálního kmene Achromobacter sp. CCM 4824 v bioreaktoru byla získána biomasa s penicilinacylasovou aktivitou jako výchozí materiál pro purifikaci enzymu. Specifická aktivita biomasy měřená se substrátem penicilin G byla 19 U·g-1 sušiny. 2. Byla vyvinuta metoda purifikace nové PGA. Specifická aktivita purifikovaného enzymu byla kolem 30 U·mg-1 proteinu s celkovým výtěžkem kolem 10 % a stupněm přečištění kolem 300. 3. Bylo zjištěno, že purifikovaný enzym se skládá ze dvou nekovalentně spojených, nestejně velkých podjednotek α a β. Přesné molekulové hmotnosti obou podjednotek byly stanoveny pomocí hmotnostní spektrometrické analýzy: α = 27,02 kDa a β = 62,45 kDa. Molekulová hmotnost β-podjednotky přibližně odpovídá hmotnostem β- podjednotek známých PGA, naopak menší α-podjednotka svou molekulovou hmotností α-podjednotky známých PGA převyšuje přibližně o 3 kDa. 4. Pomocí nativní elektroforézy a izoelektrické fokusace bylo zjištěno, že purifikovaná PGA obsahovala dvě izoformy o izoelektrických bodech pI 8,0 a 8,2. Substrátová specifita obou izoforem byla stejná, proto byla směs izoforem považována za jeden enzym. 5. Nový enzym se od známých PGA odlišuje svojí substrátovou specifitou: hydrolyzuje téměř dvojnásobnou rychlostí semisyntetická β-laktamová antibiotika, která mají na...