Dimerizace Ser/Thr proteinkinasy eukaryotního typu Streptococcus pneumoniae a charakterizace jejího substrátu, fosfoglukosaminmutasy GlmM

Abstract

104 7 Závěr 7.1 Proteinkinasa StkP Připravili jsme kmen S. pneumoniae KDTM-his, který ve svém genomu kóduje epitopem značenou kinázovou doménu proteinkinasy StkP ukotvenou do membrány pomocí transmembránové domény. Imunologickou detekcí s monoklonální protilátkou proti histidinové kotvě jsme potvrdili lokalizaci proteinu v membránové frakci S. pneumoniae. V in vitro kinázových reakcích jsme prokázali, že se jedná o plně funkční protein s autofosforylační aktivitou. Pomocí in vivo reportérového systému jsme zjistili, že transmembránová doména a extracelulární doména proteinkinasy StkP tvoří stabilní dimery. Dimerizace proteinkinasy StkP byla následně potvrzena pomocí nativní elektroforézy. Je tedy velmi pravděpodobné, že proteinkinasa StkP se in vivo vyskytuje ve formě dimeru a dimerizace je nutným předpokladem její autofosforylační aktivity. Na základě těchto výsledků jsme vyslovili hypotézu, že protein kódující kinázovou doménu postrádající transmembránovou doménu není funkční, neboť není schopen dimerizace a podléhá degradaci. 7.2 Fosfoglukosaminmutasa GlmM V in vitro kinázové reakci na bezbuněčných lyzátech S. pneumoniae Cp1015, ∆stkP a ∆phpP-stkP v přítomnosti rekombinantní proteinkinasy StkP jsme prokázali fosforylaci proteinu o molekulové hmotnosti odpovídající fosfoglukosaminmutase GlmM....

104 7 Závěr 7.1 Proteinkinasa StkP Připravili jsme kmen S. pneumoniae KDTM-his, který ve svém genomu kóduje epitopem značenou kinázovou doménu proteinkinasy StkP ukotvenou do membrány pomocí transmembránové domény. Imunologickou detekcí s monoklonální protilátkou proti histidinové kotvě jsme potvrdili lokalizaci proteinu v membránové frakci S. pneumoniae. V in vitro kinázových reakcích jsme prokázali, že se jedná o plně funkční protein s autofosforylační aktivitou. Pomocí in vivo reportérového systému jsme zjistili, že transmembránová doména a extracelulární doména proteinkinasy StkP tvoří stabilní dimery. Dimerizace proteinkinasy StkP byla následně potvrzena pomocí nativní elektroforézy. Je tedy velmi pravděpodobné, že proteinkinasa StkP se in vivo vyskytuje ve formě dimeru a dimerizace je nutným předpokladem její autofosforylační aktivity. Na základě těchto výsledků jsme vyslovili hypotézu, že protein kódující kinázovou doménu postrádající transmembránovou doménu není funkční, neboť není schopen dimerizace a podléhá degradaci. 7.2 Fosfoglukosaminmutasa GlmM V in vitro kinázové reakci na bezbuněčných lyzátech S. pneumoniae Cp1015, ∆stkP a ∆phpP-stkP v přítomnosti rekombinantní proteinkinasy StkP jsme prokázali fosforylaci proteinu o molekulové hmotnosti odpovídající fosfoglukosaminmutase GlmM....