Rekombinantní fragmenty protilátek

Abstract

6. ZÁvĚn Cílem této disertace bylo rozvinout v tuzemských podmínkách technologii příprav1, rekombinantních fragmentů protilátek a ověřit ce|ý postup na několika modelových monok|onálních protilátkách potenciálně využite|ných v diagnostice a terapii. Pro čtyři protilátky' mAb TU-20, M75, MEM97 a F||,2'32' byly zkonstnrovány rekombinantní fragmenty v ruzných formátech (scFv fragmenty monovalentní i bivalentní' tzv. diabody; intrabod)' pro intracelulámí expresi) a pro .iejich hetero|ogní expresi byly použity vektory umožňrrjícíexpresi vE. coli (ve ťormě c1,toplasmatíckých inkluzí' periplasmatických irrktuzí a v rozpustné formě) a v hmyzích 52 buňkách (exprese glykosylovaných ťorem scFv Ířagmentťr do nrédia). V případě exprese proteinťl v nerozpustne formě byly vyvinuty rel|aturačnípostupy pÍo získáni aktivních forem scFv fragmenhi. By| testován vliv délkylinkeru .(GlyaSer)". (kde x je I až4)spojujicího varíabilní doménu lehkého a těŽkého řetězce na vznik ruzných muItirnerních forem scFv. Jako optinrátní pro vznik pouze lrronon|emího scFv fragmentu se ukiizala déIka 20 arninokyse|in. ScFv s linkerem 15 arninokyse|in dlouhýn je srněsí mono-, di. a trimernich forern scFv, .;ejichž zastoupeni je ávislé na koncentraci scFv v roztoku (se vzrustajíci koncentrací vzrůstá množstvínásobných forem scFv, hlavně dimeru)....

6. CoNct usloN The aim of the thesis was to establish, in the national conditions, technology of preparation of antibody reconrbinant fragrnents and to verífo the cornplete procedure using several model monoclonal antibodies with a potential diagnostic and therapeutic use. For tfuee antibodies' mAb TU-20, M75 and MEM97, recombinant |Ťagments in various formats (scFv fragments monovalent and bivalent, i.e. diabody, and intrabody for intracellular expression) were constructed and for their heterologous expression, vectors allowing expression in E. coli (as cytoplasmic inclusions, periplasmic inclusions and in soluble form) and in Drosophila 32 cells (expression of glycosylated forms of scFv fragments into the medium) were used. In case of proteins expressed in irrsoluble form, especially scFv F|1.2.32, renaturation procedures to obtain active scFv fragments were developed and optimized. The efnect of the length of the linker -(GlyrSer).- (where x is I to 4) connecting the variable domains of the light and heavy chain on the formation of different multimeric forms of scFv rvas studied. For obtaining solell monomeric scFv fragment, the length of 20 amino acid residues tumsd out optimal. Fragnrents rvith a linker l5 residues long. formed a mixture of monomers, dimers and trimers. the proportion of rvhich rvas...