Vývoj biosenzoru pro fosfatidylinositol

Abstract

Phosphatidylinositol is a a minor membrane component of eukaryotic cells, however, it plays a crucial role in cell signaling pathways as a precursor for a number of signaling molecules and second messengers. Among the most significant ones are phosphoinositides created by phosphorylation of the hydroxyl groups of phosphatidylinositol at positions 3,4, and 5 of the inositol ring. Despite its significance, the spatial and temporal distribution and dynamics of phosphatidylinositol remains unclear owing mainly to the lack of a specific optical probe (biosensor) to visualize phosphatidylinositol in living cells. Biosensor for inositol phospholipids are based on lipid-binding domains of their effector proteins with high enough affinity and specificity for a given phosphoinositide - but nosuch domain is known for PI. However, an enzyme - phosphatidylinositol-dependent phospholipase C - that specifically recognizes phosphatidylinositol is known. This enzyme catalyzes the hydrolysis of phosphatidylinositol into diacylglycerol and inositol 1-phosphate and unlike eukaryotic homologs does not act upon the phosphorylated forms of phosphatidylinositol. The main aim of this thesis was to solve the structures of several inactive mutant forms of phospholipase C from Bacillus cereus complexed to myo-inositol which...

Fosfatidylinositol je minoritním komponentem membrán eukaryotických buněk. Vedle strukturní funkce má i zásadní roli v buněčné signalizaci jako prekursor několika signalizačních molekul a sekundárních poslů. Jedná se o fosfoinositidy, které vznikají fosforylací hydroxylových skupin fosfatidylinositolu v pozicích 3,4 a 5 inositolového kruhu. I přes důležitou roli fosfatidylinositolu však zůstává jeho prostorová a časová a dynamika v buňce nevyjasněná, především z důvodu neexistence odpovídající specifické optické próby (biosenzoru) pro jeho vizualizaci. Pro konstrukci biosenzorů pro inositolové fosfolipidy se využívají lipid-vazebné domény jejich efektorových proteinů s dostatečnou afinitou a specifitou pro daný fosfoinositid. Pro fosfatidylinositol takováto doména není známa, ale je znám enzym, bakteriální fosfatidyl-inositol specifická fosfolipasa C, který se na PI specificky váže. Tento enzym následně katalyzuje hydrolýzu fosfatidylinositolu za vzniku diacylglycerolu a inositol 1-fosfátu a na rozdíl od eukaryotických homologů neštěpí fosforylované formy fosfatidylinositolu. Cílem této diplomové práce bylo vyřešit modely struktur komplexů několika neaktivních mutantních forem fosfolipasy C z Bacillus cereus s myo-inositolem, které by dále sloužily jako podklad pro konstrukci geneticky...