Analýza fosfolipidů metodou komprehenzivní plynové chromatografie

Abstract

Fosfolipidy jsou důležitou skupinou polárních lipidů tvořících hlavní složku buněčných membrán. Jejich zastoupení se může měnit v závislosti na mnoha faktorech okolního prostředí, ve kterém se buňka nachází. Stanovení membránových fosfolipidů je nepostradatelné v mnoha vědeckých, průmyslových a hospodářských odvětví. Cílem této práce bylo vyvinout separační metodu pro stanovení membránových fosfolipidů, pomocí které by bylo možné provést analýzu fosforylovaných částí fosfolipidů i mastných kyselin z jednoho vzorku. Pro stanovení byla zvolena komprehenzivní plynová chromatografie s hmotnostní detekcí (GC×GC-MS). Tato metoda umožňuje separaci celého vzorku na dvou sériově zapojených odlišných kolonách, mezi kterými je rozhraní nazvané modulátor. Součástí přípravy vzorku bylo rozštěpení vazby v molekule fosfolipidu pomocí enzymu fosfolipasa C, čímž došlo k uvolnění fosforylovaných polárních hlav. Tyto polární části bylo nutné před analýzou derivatizovat. Princip zvolené derivatizace spočíval v použití dvou různých silylačních činidel (hexamethyldisilazan a N,O-Bis(trimethylsilyl) trifluoracetamid) ve dvou krocích. Byly vybrány podmínky pro efektivní separaci silylderivátů fosforylovaných hlav pomocí GC×GC-MS využívající kryogenní modulátor. Jednotlivé silylderiváty byly identifikovány podle...

Phospholipids are an important group of polar lipids constituting the main component of cell membranes. Their proportion may vary depending on many factors of the surrounding environment in which the cell is located. Determination of membrane phospholipids is essential in many scientific, industrial and economic sectors. The aim of this work has been to develop a separation method for determination of membrane phospholipids by which it was possible to analyze phosphorylated parts of phospholipids and fatty acids from one sample. Comprehensive gas chromatography with mass detection (GC×GC-MS) was chosen for the assay. This method allows the separation of the entire sample on two serially connected different columns, among which is the interface called modulator. The preparation of the sample includes a cleavage of the phospholipid molecule by the enzyme phospholipase C, which released the phosphorylated polar headgroups. These polar parts had to be derivatized before analysis. The principle of the chosen derivatization consisted in the use of two different silylation agents (hexamethyldisilazane and N,O-Bis(trimethylsilyl) trifluoracetamide) in two steps. Conditions were selected for efficient separation of the silylderivatives of phosphorylated headgroups using GC×GC-MS using a cryogenic...