Monitorování vybraných steroidních hormonů metodou HPLC-MS/MS a studium jejich vlivu na myší spermie in vitro.

Abstract

Tato diplomová práce byla zaměřena na vývoj nové metody využívající vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s tandemovou hmotnostní detekcí (HPLC-MS/MS) pro kvantifikaci vybraných steroidních hormonů, a to 17α-ethynylestradiolu (EE2) a progesteronu (PRG), v M2 fertilizačním médiu. Toto médium je používané při kapacitaci spermií in vitro, což je proces, kdy dochází ke komplexním molekulárně-biochemickým změnám ve spermii, na jejichž základě spermie získávají schopnost oplodnění. Fyziologický průběh tohoto procesu je tudíž zásadní pro získání fertilizační schopnosti samčích gamet. Optimalizované HPLC-MS/MS podmínky (kolona Kinetex EVO C18, mobilní fáze 50/50 (v/v) ACN/H2O, s 0,1% obsahem mravenčí kyseliny v obou složkách, průtok mobilní fáze 0,3 ml/min, nástřik 7,5 µl) byly aplikované pro sledování koncentračních změn jednotlivých analytů během časově závislé kapacitace myších spermií. Testované koncentrace pro EE2 byly 200, 20 a 2 µg/l a pro PRG pouze 200 µg/l. Bylo zjištěno, že nejprve dochází k poklesu koncentrace volného, nevázaného EE2 (minimum okolo 60. min kapacitace) a poté k jejímu opětovnému nárůstu. Tento trend vykazovaly všechny testované koncentrace. Koncentrace (200 µg/l) volného, nevázaného PRG klesala po celou dobu kapacitace. Závislosti koncentrace volného, nevázaného hormonu na...

The present project aims were development of a new sensitive separation method using high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection, which enables quantification of selected steroid hormones, namely 17α-ethynylestradiol (EE2) and progesterone (PRG) in M2 fertilizing medium. M2 medium is used during sperm capacitation in vitro, which is the physiological process of complex molecular and biochemical changes, essential for obtaining fertilizing ability of male gametes. Optimized separation and detection conditions (column Kinetex EVO C18 with mobile phase consisted of 50/50 (v/v) acetonitrile/water with 0.1% formic acid in both components) were applied on monitoring of concentration changes of each hormone during time dependent sperm capacitation. The concentration tested for EE2 were 200, 20 and 2 µg/l and for PRG 200 µg/l only. It was found that concentration of free, unbounded EE2 firstly decreases, reaches the minimum in about 60 min of capacitation and then increases again. This trend was observed for all three tested concentrations. Concentration (200 µg/l) of free unbounded PRG decreased during whole capacitation. The following kinetic analysis will be based on the concentration dependences of the free unbound hormones on the capacitation time. The results of...